تصور انهيار مخروط النمو محواري وأوائل آثار بيتا اميلويد في الماوس استزراع الخلايا العصبية
Summary
ويرد هنا بروتوكولا للتحقيق المبكر آثار اميلويد بيتا (Aβ) في الدماغ. وهذا يبين أن يستحث Aβ الالتقام كلاثرين بوساطة وانهيار النمو محواري الأقماع. البروتوكول مفيد في دراسة آثار Aβ المبكر على النمو محواري الأقماع وقد تسهل الوقاية مرض الزهايمر.
Abstract
اميلويد-بيتا (Aβ) أسباب ضعف الذاكرة في مرض الزهايمر (AD). على الرغم من أن قد ثبت المداواة لخفض مستويات Aβ في أدمغة المرضى الإعلانية، هذه لا تحسين وظائف الذاكرة. استهداف Aβ منذ Aβ المجاميع في الدماغ قبل ظهور ضعف الذاكرة، قد تكون غير فعالة لعلاج مرضى الإعلان الذي يحمل الفعل العجز في الذاكرة. ولذلك، يجب أن يتم حظر مما يشير إلى المصب بسبب ترسب Aβ قبل وضع الإعلان. يستحث Aβ تنكس محواري، مما أدى إلى تعطل شبكات الخلايا العصبية وضعف الذاكرة. على الرغم من أن هناك العديد من الدراسات على آليات سمية Aβ، مصدر سمية Aβ لا يزال غير معروف. للمساعدة في تحديد المصدر، فإننا نقترح رواية بروتوكول يستخدم الفحص المجهري والجينات تعداء وخلية يعيش التصوير إلى التحقيق المبكر التغييرات الناجمة عن Aβ في الأقماع محواري نمو الخلايا العصبية مثقف. وكشف هذا البروتوكول أن Aβ الناجم عن الالتقام كلاثرين بوساطة في النمو محواري الأقماع تليها انهيار مخروط النمو، مما يدل على أن تثبيط الالتقام يمنع السمية Aβ. هذا البروتوكول سوف تكون مفيدة في دراسة آثار Aβ المبكر وقد يؤدي إلى علاج الإعلانية أكثر كفاءة والوقائية.
Introduction
الودائع اميلويد-بيتا (Aβ) توجد في الدماغ للمرضى الذين يعانون من مرض الزهايمر (AD) وتعتبر سببا حرجة الإعلانية1 التي تعطل الشبكات العصبية، مما يؤدي إلى الذاكرة العاهات2،،من34. أظهرت العديد من العقاقير السريرية المرشحين منع بشكل فعال إنتاج اميلويد-بيتا (Aβ) أو إزالة رواسب Aβ. ومع ذلك، أي نجحت في تحسين وظيفة الذاكرة في الإعلان المرضى5. Aβ الفعل يترسب في الدماغ قبل ظهور ضعف الذاكرة6؛ ولذلك، انخفاض مستويات Aβ في أدمغة المرضى ضعف العارضة في الذاكرة قد تكون غير فعالة. الترسب Aβ موجود في السريري الإعلانية المرضى؛ ومع ذلك، نادراً ما هؤلاء المرضى الحالية مع العصبية تفسخ وذاكرة العجز6. وهناك فارق زمني بين الترسيب Aβ وضعف في الذاكرة. لذلك، يتم حظر استراتيجية بالغة الأهمية لمنع الإعلانات سمية Aβ الإشارات خلال المراحل الأولى من الإعلان، قبل وضع العجز في الذاكرة. يستحث ترسب Aβ إكسون تنكس7،8،9،10،11،،من1213، مما قد يؤدي إلى حدوث اضطراب في الشبكات العصبية والإعاقة الدائمة لوظيفة الذاكرة. وحققت العديد من الدراسات آليات Aβ السمية؛ على سبيل المثال، أظهرت محاور عصبية تحولت من أدمغة الفئران الإعلانية زادت أوتوفاجي14. ذكر Calcineurin التنشيط كآلية ممكنة ل Aβ الناجم عن تنكس محواري15؛ ومع ذلك، المشغل مباشرة من تنكس محواري لا يزال غير معروف.
وتركز هذه الدراسة على انهيار النهايات محواري يسمى الأقماع النمو. يمكن أن يكون سبب انهيار النمو محواري الأقماع طاردات محواري النمو، مثل سيمافورين-3A و A5 إفرين16،17،18،،من1920. مثل انهيار النهايات محواري تندب لوحظت في أدمغة الإعلانية المرضى،من21إلى22. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تثير عدم الأداء مخروط النمو تنكس محواري23. بيد أنه غير معروف ما إذا كان يدفع Aβ انهيار مخروط النمو. ولذلك، تقدم هذه الدراسة وضع بروتوكول رواية لمراقبة آثار Aβ المبكر في استزراع الخلايا العصبية، والتحقيق في انهيار المخروط Aβ الناجم عن النمو.
Protocol
Representative Results
Discussion
تمكين البروتوكول، المذكورة في هذه الدراسة رصد الظواهر المبكرة في نمو محواري الأقماع بعد العلاج Aβ1-42. Aβ1–42 التي يسببها الالتقام في الأقماع محواري النمو خلال 20 دقيقة، ولوحظ انهيار مخروط النمو ضمن ح 1 من العلاج. وقد توسط هذا الالتقام ربما كلاثرين. باستخدام هذا البروتوكول، أكد تثبيط الالتقام ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
بتأييد هذا العمل جزئيا بالمنح البحثية من JSPS (كاكينهي 18 ك 07389)، اليابان، ومؤسسة العلوم وتاكيدا، اليابان، وكوباياشي الصيدلانية المحدودة، اليابان.
Materials
| ddY mice | SLC | ||
| Eight-well culture slide | Falcon | 354108 | |
| poly D lysine | Wako | 168-19041 | |
| Culture medium, Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
| house serum | Gibco | 26050-088 | |
| glucose | Wako | 049-31165 | |
| L-glutamine | Wako | 074-00522 | |
| 0.05% trypsin | Gibco | 25300-054 | |
| DNase I | Worthington | DP | |
| soybean trypsin inhibitor | Gibco | 17075-029 | |
| Filter with 70 µm mesh size, cell strainer | Falcon | 352350 | |
| B-27 supplement | Gibco | 17504-044 | |
| CO2 incubator | Astec | SCA-165DS | |
| Amyloid β1-42 | Sigma-Aldrich | A9810 | |
| paraformaldehyde | Wako | 162-16065 | |
| sucrose | Wako | 196-00015 | |
| Aqueous mounting medium, Aqua-Poly/Mount | polysciences | 18606-20 | |
| Inverted microscope A | Carl Zeiss | Axio Observer Z1 | Connected with AxioCam MRm, Heating Unit XL S, CO2 Module S1, and TempModule S1 |
| Objective Plan-Apochromat 20x | Carl Zeiss | 420650-9901 | |
| Objective Plan-Apochromat 63x | Carl Zeiss | 440762-9904 | |
| Objective, CFI Plan Apo Lambda 40X | Nikon | ||
| anti-MAP2 IgG | Abcam | ab32454 | |
| anti-tau-1 IgG | Chemicon | MAB3420 | |
| anti-amyloid β antibody | IBL | 10379 | clone 11A1 |
| normal goat serum | Wako | 143-06561 | |
| bovine serum albumin | Wako | 010-25783 | |
| t-octylphenoxypolyethoxyethanol | Wako | 169-21105 | |
| goat anti-mouse IgG conjugated with AlexaFluor 594 | Invitrogen | A11032 | |
| goat anti-rabbit IgG conjugated with AlexaFluor 488 | Invitrogen | A11029 | |
| hot plate | NISSIN | NHP-M30N | |
| cover glass | Fisher Scientific | 12-545-85 | |
| 35 mm dish | IWAKI | 1000-035 | |
| Silicone RTV | Shin-Etsu | KE42T | |
| hand punch | Roper Whitney | No. XX | |
| Fluorescence membrane probe, FM1-43FX | Invitrogen | F35355 | |
| Ca2+– and Mg2+-free Hanks' balanced salt solution | Gibco | 14175-095 | |
| Transfection solution, Nucleofector solution | Lonza | VPG-1001 | |
| Electroporator, Nucleofector I | Amaxa | ||
| Inverted microscope B | Keyence | BZ-X710 | |
| Image software, ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ |
References
- Selkoe, D. J., Hardy, J. The amyloid hypothesis of Alzheimer’s disease at 25 years. EMBO Molecular Medicine. 8 (6), 595-608 (2016).
- Dickson, T. C., Vickers, J. C. The morphological phenotype of beta-amyloid plaques and associated neuritic changes in Alzheimer’s disease. Neuroscience. 105 (1), 99-107 (2001).
- Hardy, J., Selkoe, D. J. The amyloid hypothesis of Alzheimer’s disease: progress and problems on the road to therapeutics. Science. 297 (5580), 353-356 (2002).
- Perl, D. P. Neuropathology of Alzheimer’s disease. Mount Sinai Journal of Medicine. 77 (1), 32-42 (2010).
- Graham, W. V., Bonito-Oliva, A., Sakmar, T. P. Update on Alzheimer’s Disease Therapy and Prevention Strategies. Annual Review of Medicine. 68, 413-430 (2017).
- Jack, C. R., et al. Hypothetical model of dynamic biomarkers of the Alzheimer’s pathological cascade. Lancet Neurology. 9 (1), 119-128 (2010).
- Kuboyama, T., Tohda, C., Komatsu, K. Neuritic regeneration and synaptic reconstruction induced by withanolide A. British Journal of Pharmacology. 144 (7), 961-971 (2005).
- Tohda, C., Urano, T., Umezaki, M., Nemere, I., Kuboyama, T. Diosgenin is an exogenous activator of 1,25D3-MARRS/Pdia3/ERp57 and improves Alzheimer’s disease pathologies in 5XFAD mice. Scientific Reports. 2, 535 (2012).
- Jawhar, S., Trawicka, A., Jenneckens, C., Bayer, T. A., Wirths, O. Motor deficits, neuron loss, and reduced anxiety coinciding with axonal degeneration and intraneuronal Abeta aggregation in the 5XFAD mouse model of Alzheimer’s disease. Neurobiology of Aging. 33 (1), e129-e140 (2012).
- Postuma, R. B., et al. Substrate-bound beta-amyloid peptides inhibit cell adhesion and neurite outgrowth in primary neuronal cultures. Journal of Neurochemistry. 74 (3), 1122-1130 (2000).
- Tohda, C., Nakada, R., Urano, T., Okonogi, A., Kuboyama, T. Kamikihi-to (KKT) rescues axonal and synaptic degeneration associated with memory impairment in a mouse model of Alzheimer’s disease, 5XFAD. International Journal of Neuroscience. 121 (12), 641-648 (2011).
- Tsai, J., Grutzendler, J., Duff, K., Gan, W. B. Fibrillar amyloid deposition leads to local synaptic abnormalities and breakage of neuronal branches. Nature Neuroscience. 7 (11), 1181-1183 (2004).
- Wirths, O., Weis, J., Kayed, R., Saido, T. C., Bayer, T. A. Age-dependent axonal degeneration in an Alzheimer mouse model. Neurobiology of Aging. 28 (11), 1689-1699 (2007).
- Sanchez-Varo, R., et al. Abnormal accumulation of autophagic vesicles correlates with axonal and synaptic pathology in young Alzheimer’s mice hippocampus. Acta Neuropathologica. 123 (1), 53-70 (2012).
- Wu, H. Y., et al. Amyloid beta induces the morphological neurodegenerative triad of spine loss, dendritic simplification, and neuritic dystrophies through calcineurin activation. Journal of Neuroscience. 30 (7), 2636-2649 (2010).
- Campbell, D. S., Holt, C. E. Chemotropic responses of retinal growth cones mediated by rapid local protein synthesis and degradation. Neuron. 32 (6), 1013-1026 (2001).
- Jurney, W. M., Gallo, G., Letourneau, P. C., McLoon, S. C. Rac1-mediated endocytosis during ephrin-A2- and semaphorin 3A-induced growth cone collapse. Journal of Neuroscience. 22 (14), 6019-6028 (2002).
- Luo, Y., Raible, D., Raper, J. A. Collapsin: a protein in brain that induces the collapse and paralysis of neuronal growth cones. Cell. 75 (2), 217-227 (1993).
- Nicol, X., Muzerelle, A., Rio, J. P., Metin, C., Gaspar, P. Requirement of adenylate cyclase 1 for the ephrin-A5-dependent retraction of exuberant retinal axons. Journal of Neuroscience. 26 (3), 862-872 (2006).
- Wu, K. Y., et al. Local translation of RhoA regulates growth cone collapse. Nature. 436 (7053), 1020-1024 (2005).
- Benes, F. M., Farol, P. A., Majocha, R. E., Marotta, C. A., Bird, E. D. Evidence for axonal loss in regions occupied by senile plaques in Alzheimer cortex. Neuroscience. 42 (3), 651-660 (1991).
- Masliah, E., et al. An antibody against phosphorylated neurofilaments identifies a subset of damaged association axons in Alzheimer’s disease. American Journal of Pathology. 142 (3), 871-882 (1993).
- Zhou, F. Q., Snider, W. D. Intracellular control of developmental and regenerative axon growth. Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological sciences. 361 (1473), 1575-1592 (2006).
- Teshigawara, K., et al. A novel compound, denosomin, ameliorates spinal cord injury via axonal growth associated with astrocyte-secreted vimentin. British Journal of Pharmacology. 168 (4), 903-919 (2013).
- Kuboyama, T., Tohda, C., Komatsu, K. Withanoside IV and its active metabolite, sominone, attenuate A beta(25-35)-induced neurodegeneration. European Journal of Neuroscience. 23 (6), 1417-1426 (2006).
- Tanabe, N., Kuboyama, T., Tohda, C. Matrine Directly Activates Extracellular Heat Shock Protein 90, Resulting in Axonal Growth and Functional Recovery in Spinal Cord Injured-Mice. Frontiers in Pharmacology. 9 (446), (2018).
- Kuboyama, T., Lee, Y. A., Nishiko, H., Tohda, C. Inhibition of clathrin-mediated endocytosis prevents amyloid beta-induced axonal damage. Neurobiology of Aging. 36 (5), 1808-1819 (2015).
- Pike, C. J., Walencewicz, A. J., Glabe, C. G., Cotman, C. W. In vitro aging of beta-amyloid protein causes peptide aggregation and neurotoxicity. Brain Research. 563 (1-2), 311-314 (1991).
- Uchida, N., et al. Yokukansan inhibits social isolation-induced aggression and methamphetamine-induced hyperlocomotion in rodents. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 32 (3), 372-375 (2009).
- Pike, C. J., Burdick, D., Walencewicz, A. J., Glabe, C. G., Cotman, C. W. Neurodegeneration induced by beta-amyloid peptides in vitro: the role of peptide assembly state. Journal of Neuroscience. 13 (4), 1676-1687 (1993).
- Kuboyama, T., Hirotsu, K., Arai, T., Yamasaki, H., Tohda, C. Polygalae Radix Extract Prevents Axonal Degeneration and Memory Deficits in a Transgenic Mouse Model of Alzheimer’s Disease. Frontiers in Pharmacology. 8, 805 (2017).
- Dotti, C. G., Sullivan, C. A., Banker, G. A. The establishment of polarity by hippocampal neurons in culture. Journal of Neuroscience. 8 (4), 1454-1468 (1988).
- Arimura, N., Kaibuchi, K. Neuronal polarity: from extracellular signals to intracellular mechanisms. Nature Reviews: Neuroscience. 8 (3), 194-205 (2007).
- De Felice, F. G., et al. Alzheimer’s disease-type neuronal tau hyperphosphorylation induced by A beta oligomers. Neurobiology of Aging. 29 (9), 1334-1347 (2008).
- Izuo, N., et al. Toxicity in Rat Primary Neurons through the Cellular Oxidative Stress Induced by the Turn Formation at Positions 22 and 23 of Aβ42. ACS Chemical Neuroscience. 3 (9), 674-681 (2012).
- Fujiwara, H., et al. Uncaria rhynchophylla, a Chinese medicinal herb, has potent antiaggregation effects on Alzheimer’s beta-amyloid proteins. Journal of Neuroscience Research. 84 (2), 427-433 (2006).
- Murakami, K., et al. Monoclonal antibody against the turn of the 42-residue amyloid beta-protein at positions 22 and 23. ACS Chemical Neuroscience. 1 (11), 747-756 (2010).
- Ford, M. G., et al. Simultaneous binding of PtdIns(4,5)P2 and clathrin by AP180 in the nucleation of clathrin lattices on membranes. Science. 291 (5506), 1051-1055 (2001).
- Tojima, T., Itofusa, R., Kamiguchi, H. Asymmetric clathrin-mediated endocytosis drives repulsive growth cone guidance. Neuron. 66 (3), 370-377 (2010).
- Ahmed, G., et al. Draxin inhibits axonal outgrowth through the netrin receptor DCC. Journal of Neuroscience. 31 (39), 14018-14023 (2011).
- Brennaman, L. H., Moss, M. L., Maness, P. F. EphrinA/EphA-induced ectodomain shedding of neural cell adhesion molecule regulates growth cone repulsion through ADAM10 metalloprotease. Journal of Neurochemistry. 128 (2), 267-279 (2014).
- Tojima, T., et al. Attractive axon guidance involves asymmetric membrane transport and exocytosis in the growth cone. Nature Neuroscience. 10 (1), 58-66 (2007).
- Ooashi, N., Futatsugi, A., Yoshihara, F., Mikoshiba, K., Kamiguchi, H. Cell adhesion molecules regulate Ca2+-mediated steering of growth cones via cyclic AMP and ryanodine receptor type 3. Journal of Cell Biology. 170 (7), 1159-1167 (2005).
- Biswas, S., Kalil, K. The Microtubule-Associated Protein Tau Mediates the Organization of Microtubules and Their Dynamic Exploration of Actin-Rich Lamellipodia and Filopodia of Cortical Growth Cones. Journal of Neuroscience. 38 (2), 291-307 (2018).
- Kuboyama, T., et al. Paxillin phosphorylation counteracts proteoglycan-mediated inhibition of axon regeneration. Experimental Neurology. 248, 157-169 (2013).
