本文介绍了一种研究淀粉样蛋白β (Aβ) 在脑内早期作用的实验方案。 这表明 Aβ诱导网格蛋白介导的内吞和轴突生长锥的崩溃。该协议有助于研究 Aβ对轴突生长锥的早期影响, 并可促进预防阿尔茨海默病。
淀粉样蛋白β (Aβ) 导致阿尔茨海默病 (AD) 的记忆力受损。虽然治疗已被证明减少 Aβ水平在 AD 患者的大脑, 这些不改善记忆功能。由于 Aβ在大脑出现记忆障碍之前聚集在脑中, 针对 Aβ可能对已经出现内存不足的 AD 患者的治疗效率低下。因此, 在 AD 开发之前, 应阻止 Aβ沉积引起的下游信令。Aβ诱导轴突变性, 导致神经元网络的中断和记忆障碍。虽然对 Aβ毒性机理有许多研究, 但 Aβ毒性的来源尚不得而知。为了帮助识别来源, 我们提出了一种新的协议, 使用显微学, 基因转染和活细胞成像来研究 Aβ在培养神经元轴突生长锥中引起的早期变化。该协议揭示了 Aβ诱导网格蛋白介导的内吞在轴突生长锥后的生长锥塌陷, 表明抑制内吞可防止 Aβ毒性。该协议将有助于研究 Aβ的早期影响, 并可能导致更有效和预防性的广告治疗。
淀粉样β (Aβ) 沉积在阿尔茨海默氏病患者的大脑中被发现, 并且被认为是 ad1破坏神经元网络的一个关键原因, 导致记忆障碍2,3,4。许多临床药物候选者已被证明有效地防止淀粉样β (Aβ) 生产或去除 Aβ沉积物。然而, 没有人成功地改善了 AD 患者的记忆功能5。Aβ在记忆障碍发生前已经存入大脑6;因此, 降低记忆力受损患者大脑中的 Aβ水平可能无效。Aβ沉积在临床前 AD 患者中存在;然而, 这些患者很少出现神经元变性和记忆缺陷6。Aβ沉积与记忆损伤之间存在时间滞后。因此, 防止广告的关键策略是在广告的早期阶段阻断 Aβ毒性信号, 在内存赤字发展之前。Aβ沉积诱发轴突变性7,8,9,10,11,12,13, 这可能导致中断神经网络和记忆功能的永久性损伤。许多研究已经研究了 Aβ毒性的机制;例如, AD 小鼠大脑的退化轴突已被证明有增加自噬14。钙调素激活已被报告为 Aβ诱发的轴突变性15的可能机制;然而, 直接触发轴突变性仍然未知。
这项研究的重点是轴突末端称为生长锥的崩溃。轴突生长锥的崩溃可能是由轴突生长驱蚊引起的, 如 semaphorin-3A 和 ephrin-A516、17、18、19、20。在 AD 患者的大脑中观察到类似塌陷的营养不良轴突结局21,22。此外, 生长锥功能的失败可能引发轴突变性23。然而, Aβ是否诱发生长锥塌陷尚不得而知。因此, 本研究提出了一种新的实验方案, 观察 Aβ在培养神经元中的早期作用, 研究 Aβ诱导的生长锥塌陷。
本研究所述的协议使 Aβ1-42 治疗后轴突生长锥早期现象的观察。Aβ1-42 诱导内吞在轴突生长锥20分钟内, 并在1小时内观察到生长锥塌陷。这个内吞可能是由网格蛋白介导的。通过使用本协议, 证实了网格蛋白介导内吞的抑制, 防止 Aβ1-42-induced 生长锥塌陷和神经元轴突变性27。此外, 抑制网格蛋白介导的内吞减弱 Aβ1-42-induced 轴突变性和记忆缺陷在体内27。这?…
The authors have nothing to disclose.
这项工作得到了来自日本、武田科学基金会、日本 KAKENHI 18K07389、日本小林制药株式会社的研究资助的部分支持。
ddY mice | SLC | ||
Eight-well culture slide | Falcon | 354108 | |
poly D lysine | Wako | 168-19041 | |
Culture medium, Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
house serum | Gibco | 26050-088 | |
glucose | Wako | 049-31165 | |
L-glutamine | Wako | 074-00522 | |
0.05% trypsin | Gibco | 25300-054 | |
DNase I | Worthington | DP | |
soybean trypsin inhibitor | Gibco | 17075-029 | |
Filter with 70 µm mesh size, cell strainer | Falcon | 352350 | |
B-27 supplement | Gibco | 17504-044 | |
CO2 incubator | Astec | SCA-165DS | |
Amyloid β1-42 | Sigma-Aldrich | A9810 | |
paraformaldehyde | Wako | 162-16065 | |
sucrose | Wako | 196-00015 | |
Aqueous mounting medium, Aqua-Poly/Mount | polysciences | 18606-20 | |
Inverted microscope A | Carl Zeiss | Axio Observer Z1 | Connected with AxioCam MRm, Heating Unit XL S, CO2 Module S1, and TempModule S1 |
Objective Plan-Apochromat 20x | Carl Zeiss | 420650-9901 | |
Objective Plan-Apochromat 63x | Carl Zeiss | 440762-9904 | |
Objective, CFI Plan Apo Lambda 40X | Nikon | ||
anti-MAP2 IgG | Abcam | ab32454 | |
anti-tau-1 IgG | Chemicon | MAB3420 | |
anti-amyloid β antibody | IBL | 10379 | clone 11A1 |
normal goat serum | Wako | 143-06561 | |
bovine serum albumin | Wako | 010-25783 | |
t-octylphenoxypolyethoxyethanol | Wako | 169-21105 | |
goat anti-mouse IgG conjugated with AlexaFluor 594 | Invitrogen | A11032 | |
goat anti-rabbit IgG conjugated with AlexaFluor 488 | Invitrogen | A11029 | |
hot plate | NISSIN | NHP-M30N | |
cover glass | Fisher Scientific | 12-545-85 | |
35 mm dish | IWAKI | 1000-035 | |
Silicone RTV | Shin-Etsu | KE42T | |
hand punch | Roper Whitney | No. XX | |
Fluorescence membrane probe, FM1-43FX | Invitrogen | F35355 | |
Ca2+– and Mg2+-free Hanks' balanced salt solution | Gibco | 14175-095 | |
Transfection solution, Nucleofector solution | Lonza | VPG-1001 | |
Electroporator, Nucleofector I | Amaxa | ||
Inverted microscope B | Keyence | BZ-X710 | |
Image software, ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ |