Síntese e caracterização de placentária Condroitina sulfato de uma (plCSA) - Targeting Lipid - nanopartículas de polímero
Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para a síntese de sulfato de condroitina placentária A peptídeo de vinculação (plCSA-BP)-conjugados lipid-polímero nanopartículas através de etapa única sonication e bioconjugate técnicas. Estas partículas constituem uma nova ferramenta para a entrega de alvo da terapêutica de tumores mais humanos e trophoblasts da placenta para tratar cancros e anormalidades da placenta.
Abstract
Um método terapêutico eficaz câncer reduz e elimina tumores com mínima toxicidade sistêmica. Nanopartículas ativamente direcionamento oferecem uma abordagem promissora para a terapia do câncer. O sulfato de condroitina placentária glicosaminoglicano um (plCSA) é expressa em uma ampla gama de células cancerosas e trophoblasts da placenta e proteína da malária que var2csa especificamente pode ligar para plCSA. Um peptídeo de sulfato de condroitina placentária relatado A ligação (plCSA-BP), derivado da malária proteína VAR2CSA, especificamente também pode ligar para plCSA em células cancerosas e trophoblasts placentárias. Daí, nanopartículas plCSA-BP-conjugado podem ser usadas como uma ferramenta para entrega de drogas específicas para cânceres humanos e trophoblasts placentárias. Neste protocolo, descrevemos um método para sintetizar lipídios plCSA-BP-conjugados-polímero nanopartículas carregadas com doxorrubicina (plCSA-DNPs); o método consiste em um único sonication passo e bioconjugate técnicas. Além disso, vários métodos para caracterizar plCSA-DNPs, incluindo a determinação de suas propriedades físico-químicas e celular captação pelas células da placenta Coriocarcinoma (JEG3), são descritos.
Introduction
Um método terapêutico eficaz câncer reduz e elimina tumores com mínima toxicidade sistêmica. Daí, tumor seletivo segmentação é a chave para explorar métodos terapêuticos bem sucedidos. Nanopartículas para oferecer uma oportunidade promissora para a terapia do câncer, e moleculares assemblies com diferentes grupos funcionais irão melhorar a eficácia da droga e reduzir os efeitos colaterais associados1,2. Além disso, os sistemas de nanopartículas principalmente utilizam passiva e ativa como alvo para atingir o alvo tumores3.
Segmentação passiva explora as características inatas de nanopartículas e permeabilidade reforçada e efeitos de retenção (EPR) para alcançar as células do tumor. Os lipossomas catiônicos têm sido utilizados com sucesso para entregar várias drogas anticâncer para tumores em aplicações clínicas4,5,6. Apesar do potencial efeito terapêutico eficaz do cancro, uma concentração baixa de drogas na região de tumor e uma incapacidade de distinguir as células do tumor de tecidos normais são duas limitações principais de nanopartículas de direcionamento de passivo-7.
Estratégias de segmentação ativas aproveitam do antígeno-anticorpo, ligante-receptor e outras interações de reconhecimento molecular para entregar drogas especificamente tumores8. O sulfato de condroitina placentária glicosaminoglicano um (plCSA) é amplamente expresso na maioria das células cancerosas e trophoblasts placentárias. Além disso, a proteína da malária VAR2CSA especificamente pode ligar para plCSA9,10. Portanto, o VAR2CSA pode ser uma ferramenta para o direcionamento de células cancerosas humanas. No entanto, quando VAR2CSA é conjugada com nanopartículas, a proteína completo pode limitar a penetração de nanopartículas em células tumorais. Recentemente, descobrimos um peptídeo de vinculação de plCSA (plCSA-BP), derivado da proteína da malária VAR2CSA. nanopartículas de lipídios-polímero plCSA-BP-conjugados rapidamente ligado a células de Coriocarcinoma e doxorrubicina significativamente aumentada (DOX) atividade anticancerígena em vivo11; Estas partículas também especificamente ligados a trophoblasts da placenta e podem servir como uma ferramenta para a entrega de alvo de drogas para a placenta12.
Nanopartículas de lipídios-polímero consistem em um escudo de monocamada lipídico e um núcleo de polímero hidrofóbico e representam uma nova transportadora para a entrega da droga. Essas nanopartículas combinam as vantagens de lipossomas e nanocarriers poliméricos, tais como tamanho controlável de nanopartículas, alta biocompatibilidade, liberação de drogas sustentado, eficiência de carregamento de droga alta (LE) e excelente estabilidade13. Neste trabalho, usamos um método passo a passo sonication para sintetizar lipídios-polímero nanopartículas. Este método é rápido, conveniente e apropriado para aumentar e tem sido amplamente utilizado para preparar as nanopartículas de lipídios-polímero do nosso grupo11,14 e outros15,16,17,18 .
1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) cloridrato de carbodiimida (EDC) é uma popular carbodiimida usada como um agente de reticulação para conjugar biomoléculas contendo aminas e carboxilatos19. Além de EDC, N-hydroxysulfosuccinimide (NHS) é o reagente de conjugação mais comum na superfície e nanopartículas conjugação reações20,21. NHS pode reduzir o número de reações colaterais e melhorar a estabilidade e o rendimento do éster intermediários22,23.
Aqui, descrevemos um protocolo para a síntese de nanopartículas de lipídios-polímero plCSA-alvo. Primeiro, a síntese de etapa única sonication de nanopartículas de lipídios-polímero DOX-carregado (DNPs) é descrita. Então, uma técnica de bioconjugate EDC/NHS para a geração de nanopartículas de lipídios plCSA-BP-conjugados-polímero é introduzida. Esta técnica de bioconjugate também pode ser usada para conjugar outros anticorpos e peptídeos de nanopartículas. Finalmente, descrevemos o ensaio físico-químico de propriedades e in vitro usado para caracterizar as nanopartículas de lipídios-polímero plCSA-alvo. Acreditamos que essas nanopartículas de lipídios-polímero plCSA-alvo poderiam constituir um sistema eficaz para a entrega de alvo de drogas para cânceres mais humanos e a alvo entrega de cargas para a placenta para tratar anormalidades da placenta.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo fornece um método eficiente e reproduzível para a síntese de nanopartículas de lipídios-polímero plCSA-BP-conjugados. O método passo a passo sonication para preparar nanopartículas de lipídios-polímero é rápido, reprodutível e diferente do típico nanoprecipitation métodos que envolvem o aquecimento, evaporação ou num Vortex. Portanto, o método desenvolvido reduz significativamente o tempo de síntese. Além disso, a EDC/NHS bioconjugate utilizado neste protocolo é uma técnica comumente …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado por doações da pesquisa nacional de chave e programa de desenvolvimento da China (2016YFC1000402), Fundação Nacional de ciências naturais (81571445 e 81771617) e a ciência Natural Fundação da província de Guangdong (2016A030313178) para O fundo de investigação do Basic de Shenzhen (JCYJ20170413165233512) para X.F. e X.F.
Materials
| plCSA peptide | Shanghai GL Biochem | 573518 | for peptide synthesis |
| Ethanol absolute | Sinopharm Chemical | 10009218 | for nanoparticles synthesis |
| Soybean lecithin | Avanti Polar Lipids | 441601 | for nanoparticles synthesis |
| DSPE-PEG-COOH | Avanti Polar Lipids | 880125 | for nanoparticles synthesis |
| Doxorubicin | JKChemical | 113424 | for nanoparticles synthesis |
| Acetonitrile | Shanghai Lingfeng | 1008621 | for nanoparticles synthesis |
| PLGA | Sigma-Aldrich | 719897 | for nanoparticles synthesis |
| Ultrasonic processor | Sonics | VCX130 | for nanoparticles synthesis |
| Centrifuge filter (MWCO 10 kDa) | Millipore | UFC801024 | for nanoparticles purification |
| centrifuge | Sigma | 3-18KS | for nanoparticles purification |
| 2-[morpholino]ethanesulfonic acid(MES) | Sigma-Aldrich | M3671 | for peptide conjugation |
| 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC) | Sigma-Aldrich | 3450 | for peptide conjugation |
| N-hydroxysuccinimide (NHS) | Sigma-Aldrich | 56480 | for peptide conjugation |
| Dialysis bags | Spectrum | 132592T | for nanoparticles purification |
| PBS | Hyclone | SH30028.01 | for cell culture |
| 10 mL centrifuge tubes, polypropylene | Aladdin | S-025 | for nanoparticles synthesis |
| 15 mL centrifuge tubes, polypropylene | Corning | 430791 | for various applications |
| 0.22 μm sterile syringe filter | Millipore | SLGV033RB | for nanoparticles purification |
| 1 ml syringe, polypropylene | BD | 328421 | for nanoparticles synthesis |
| Malvern Zetasizer | Malvern | Nano ZS | for particle size analyer |
| Phosphotungstic acid | for TEM | ||
| TEM grid | EMCN | BZ10024a | for TEM |
| UV-VIS spectrometer | Leagene | DZ0035 | for TEM |
| Transmission electron microscope |
JEOL | JEM-100CXII | for particle size analyer |
| BCA reagent A | Thermo Fisher Scientific | 23228 | for BCA assay |
| BCA reagent B | Thermo Fisher Scientific | 23224 | for BCA assay |
| 96-Well Plates | Corning | 3599 | for BCA assay |
| Plate reader | Thermo Fisher Scientific | Multiskan™ GO | for BCA assay |
| 12-well plates | Corning | 3513 | for cell culture |
| JEG3 cell | Cell Bank of the Chinese Academy of Sciences | TCHu195 | Human placenta |
| DMEM/F12 | Hyclone | SH30272.01 | phenol red-free |
| Fetal bovine serum (FBS) | GIBCO | 10100 | for cell culture |
| Penicillin/streptomycin | GIBCO | 15070063 | for cell culture |
| Fluorescence microscope | OLYMPUS | CKK53 | for celluar uptake |
| Paraformaldehyde | Shanghai Lingfeng | 1372021 | for celluar uptake |
| DAPI | Sangon Biotech | A606584 | for celluar uptake |
| Mounting medium | Life | P36961 | for celluar uptake |
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