Nous présentons ici un protocole pour la synthèse de peptide de liaison placentaire chondroïtine sulfate A (plCSA-BP)-conjugués de lipide-polymère nanoparticules via seule étape sonication et bioconjugate techniques. Ces particules constituent un nouvel outil pour l’administration ciblée d’agents thérapeutiques tumeurs plus humaines et les trophoblastes placentaires pour traiter des cancers et des troubles placentaires.
Une méthode thérapeutique efficace cancer réduit et élimine les tumeurs avec une toxicité systémique minimale. NANOPARTICULES activement ciblage offrent une approche prometteuse pour le traitement du cancer. Le sulfate de chondroïtine placentaire glycosaminoglycan un (plCSA) s’exprime sur une large gamme de cellules cancéreuses trophoblastes placentaires et protéine malarique VAR2CSA peut se lier spécifiquement à plCSA. Un peptide de liaison déclarés placentaire chondroïtine sulfate A (plCSA-BP), dérivé de protéine malarique VAR2CSA, pouvez également spécifiquement lier à plCSA sur les cellules cancéreuses et les trophoblastes placentaires. C’est pourquoi, plCSA-BP-conjugués de nanoparticules pourraient servir un outil pour la livraison de médicaments ciblés aux cancers humains et trophoblastes placentaires. Dans le présent protocole, on décrit une méthode pour faire la synthèse des nanoparticules de plCSA-BP-conjugué lipide-polymère chargés avec la doxorubicine (plCSA-DNPs) ; la méthode consiste à une sonication seule étape et bioconjugate techniques. En outre, plusieurs méthodes pour caractériser plCSA-DNPs, y compris la détermination de leurs propriétés physico-chimiques et la capture cellulaire de cellules de choriocarcinome placentaire (JEG3), sont décrites.
Une méthode thérapeutique efficace cancer réduit et élimine les tumeurs avec une toxicité systémique minimale. Par conséquent, ciblage tumoral sélective est la clé à l’exploration de méthodes thérapeutiques efficaces. NANOPARTICULES offrent une opportunité prometteuse pour le traitement du cancer et des assemblages moléculaires avec différents groupes fonctionnels améliorera l’efficacité du médicament et réduire des effets secondaires associés1,2. En outre, des systèmes de nanoparticules utilisent principalement passives et actives visant à atteindre la cible des tumeurs3.
Ciblage passive exploite les caractéristiques innées des nanoparticules et perméabilité améliorée et des effets de rétention (EPR) pour atteindre les cellules tumorales. Les liposomes cationiques ont été utilisés avec succès pour libérer des médicaments anticancéreux diverses tumeurs dans des applications cliniques4,5,6. Malgré l’effet thérapeutique potentiel de cancer efficace, une concentration faible de drogue dans la région de la tumeur et une incapacité à distinguer les cellules tumorales des tissus normaux sont les deux principales limites de nanoparticules de ciblage passif7.
Les stratégies de ciblage actifs Profitez d’antigène-anticorps, ligand-récepteur et autres interactions de reconnaissance moléculaire à libérer spécifiquement des médicaments tumeurs8. Le sulfate de chondroïtine placentaire glycosaminoglycan un (plCSA) est largement exprimé sur la plupart des cellules cancéreuses et des trophoblastes placentaires. En outre, la protéine malarique VAR2CSA pouvez spécifiquement lier à plCSA9,10. Par conséquent, VAR2CSA peut être un outil pour cibler les cellules cancéreuses humaines. Cependant, lorsque VAR2CSA est conjugué aux nanoparticules, la protéine pleine longueur peut-être limiter la pénétration des nanoparticules dans les cellules tumorales. Récemment, nous avons découvert un peptide de la liaison plCSA (plCSA-BP), dérivé de la protéine malarique VAR2CSA. plCSA-BP-conjugué lipide-polymère nanoparticules rapidement collé sur choriocarcinome cellules et une augmentation significative de doxorubicine (DOX) activité anticancéreuse in vivo11; ces particules aussi spécifiquement lié à trophoblastes placentaires et pourraient servir d’outil pour l’administration ciblée des médicaments au placenta12.
NANOPARTICULES lipidiques-polymère sont constitués d’une enveloppe de monocouche de lipides et un noyau de polymère hydrophobe et représentent un nouveau transporteur pour la livraison de drogue. Ces nanoparticules combinent les avantages des liposomes et nanocarriers polymères, tels que les nanoparticules contrôlables taille haute biocompatibilité, libération du médicament soutenue, drogue haute chargement (LE) et l’efficacité excellente stabilité13. Dans ce travail, nous avons utilisé une méthode seule étape sonication à synthétiser des nanoparticules lipidiques-polymère. Cette méthode est rapide, pratique et adapté pour l’intensification et a été largement utilisée pour préparer des nanoparticules lipidiques-polymère par notre groupe de11,14 et d’autres15,16,17,18 .
1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) chlorhydrate de carbodiimide (EDC) est un populaire carbodiimide, utilisé comme un agent de réticulation pour la conjugaison des biomolécules contenant des amines et carboxylates19. En plus de l’EDC, N-hydroxysulfosuccinimide (NHS) est le plus commun réactif de conjugaison en surface et nanoparticules conjugaison réactions20,21. NHS peut réduire le nombre de réactions secondaires et améliorer la stabilité et le rendement d’ester INTERMEDIAIRES22,23.
Nous décrivons ici un protocole pour la synthèse de nanoparticules lipidiques-polymère plCSA ciblées. Tout d’abord, la synthèse de la seule étape sonication de nanoparticules lipidiques-polymère DOX-chargé (DNPs) est décrite. Ensuite, une technique de bioconjugate EDC/NHS pour générer des nanoparticules de polymère lipidique plCSA-BP-conjugué est introduite. Cette technique de bioconjugate permet aussi de conjuguer les autres anticorps et les peptides aux nanoparticules. Enfin, nous décrivons le dosage physico-chimiques, propriétés et in vitro , utilisé pour caractériser des nanoparticules lipidiques-polymère plCSA ciblées. Nous croyons que ces nanoparticules lipidiques-polymère plCSA ciblées pourraient constituer un système efficace pour l’administration ciblée des médicaments à des cancers plus humains et de l’administration ciblée de charges utiles pour le placenta pour traiter les troubles placentaires.
Ce protocole fournit une méthode efficace et reproductible pour la synthèse de nanoparticules de polymère lipidique plCSA-BP-conjugués. La méthode de sonication seule étape pour préparer les nanoparticules lipidiques-polymère est rapide, reproductible et différente des méthodes nanoprécipitation typique qui impliquent chauffage, Vortex ou évaporation. Par conséquent, la méthode développée réduit considérablement le temps de la synthèse. En outre, l’EDC/NHS bioconjugate utilisé dans le présent proto…
The authors have nothing to disclose.
Ce travail a été soutenu grâce à des subventions de la clé National de recherche et programme de développement de Chine (2016YFC1000402), la Fondation nationale des Sciences naturelles (81571445 et 81771617) et la Fondation sciences naturelles de la Province de Guangdong (2016A030313178) à X.F. et le Fonds de recherche de Shenzhen Basic (JCYJ20170413165233512) à X.F.
plCSA peptide | Shanghai GL Biochem | 573518 | for peptide synthesis |
Ethanol absolute | Sinopharm Chemical | 10009218 | for nanoparticles synthesis |
Soybean lecithin | Avanti Polar Lipids | 441601 | for nanoparticles synthesis |
DSPE-PEG-COOH | Avanti Polar Lipids | 880125 | for nanoparticles synthesis |
Doxorubicin | JKChemical | 113424 | for nanoparticles synthesis |
Acetonitrile | Shanghai Lingfeng | 1008621 | for nanoparticles synthesis |
PLGA | Sigma-Aldrich | 719897 | for nanoparticles synthesis |
Ultrasonic processor | Sonics | VCX130 | for nanoparticles synthesis |
Centrifuge filter (MWCO 10 kDa) | Millipore | UFC801024 | for nanoparticles purification |
centrifuge | Sigma | 3-18KS | for nanoparticles purification |
2-[morpholino]ethanesulfonic acid(MES) | Sigma-Aldrich | M3671 | for peptide conjugation |
1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC) | Sigma-Aldrich | 3450 | for peptide conjugation |
N-hydroxysuccinimide (NHS) | Sigma-Aldrich | 56480 | for peptide conjugation |
Dialysis bags | Spectrum | 132592T | for nanoparticles purification |
PBS | Hyclone | SH30028.01 | for cell culture |
10 mL centrifuge tubes, polypropylene | Aladdin | S-025 | for nanoparticles synthesis |
15 mL centrifuge tubes, polypropylene | Corning | 430791 | for various applications |
0.22 μm sterile syringe filter | Millipore | SLGV033RB | for nanoparticles purification |
1 ml syringe, polypropylene | BD | 328421 | for nanoparticles synthesis |
Malvern Zetasizer | Malvern | Nano ZS | for particle size analyer |
Phosphotungstic acid | for TEM | ||
TEM grid | EMCN | BZ10024a | for TEM |
UV-VIS spectrometer | Leagene | DZ0035 | for TEM |
Transmission electron microscope |
JEOL | JEM-100CXII | for particle size analyer |
BCA reagent A | Thermo Fisher Scientific | 23228 | for BCA assay |
BCA reagent B | Thermo Fisher Scientific | 23224 | for BCA assay |
96-Well Plates | Corning | 3599 | for BCA assay |
Plate reader | Thermo Fisher Scientific | Multiskan™ GO | for BCA assay |
12-well plates | Corning | 3513 | for cell culture |
JEG3 cell | Cell Bank of the Chinese Academy of Sciences | TCHu195 | Human placenta |
DMEM/F12 | Hyclone | SH30272.01 | phenol red-free |
Fetal bovine serum (FBS) | GIBCO | 10100 | for cell culture |
Penicillin/streptomycin | GIBCO | 15070063 | for cell culture |
Fluorescence microscope | OLYMPUS | CKK53 | for celluar uptake |
Paraformaldehyde | Shanghai Lingfeng | 1372021 | for celluar uptake |
DAPI | Sangon Biotech | A606584 | for celluar uptake |
Mounting medium | Life | P36961 | for celluar uptake |