Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Synthese von Plazenta Chondroitinsulfat A Bindung Peptid (PlCSA-BP)-konjugiert Lipid-Polymer Nanopartikel über einstufigen Beschallung und Bioconjugate Techniken. Diese Partikel bilden ein neuartiges Instrument für die gezielte Bereitstellung von Therapeutika, die meisten menschlichen Tumoren und Plazenta Trophoblasten zur Behandlung von Krebserkrankungen und plazentare Störungen.
Eine wirksame Krebs therapeutische Methode reduziert und beseitigt Tumoren mit minimaler systemischer Toxizität. Aktiv targeting Nanopartikel bieten einen vielversprechenden Ansatz in der Krebstherapie. Plazentar Chondroitinsulfat Glykosaminoglykan (PlCSA) drückt sich auf einer Vielzahl von Krebszellen und Plazenta Trophoblasten und Malaria Protein, das VAR2CSA speziell an PlCSA binden können. Eine gemeldete plazentar Chondroitinsulfat A Bindung Peptid (PlCSA-BP), abgeleitet von Malaria Protein VAR2CSA, kann auch speziell an PlCSA auf Krebszellen und Plazenta Trophoblasten binden. Infolgedessen konnte PlCSA-BP-konjugiert Nanopartikel als Instrument zur zielgerichteten Wirkstoffabgabe menschlichen Krebserkrankungen und Plazenta Trophoblasten eingesetzt werden. In diesem Protokoll beschreiben wir eine Methode zu synthetisieren, PlCSA-BP-konjugiert Lipid-Polymer Nanopartikel geladen mit Doxorubicin (PlCSA-DNPs); die Methode besteht aus einer einzigen Beschallung Schritt und Bioconjugate Techniken. Darüber hinaus werden verschiedene Methoden zur Charakterisierung von PlCSA-DNPs, einschließlich der Bestimmung ihrer physikalisch-chemischen Eigenschaften und zelluläre Aufnahme durch plazentare Choriocarcinoma (JEG3) Zellen beschrieben.
Eine wirksame Krebs therapeutische Methode reduziert und beseitigt Tumoren mit minimaler systemischer Toxizität. Daher ist die selektive Tumor targeting der Schlüssel zum erfolgreiche therapeutischen Methoden zu erforschen. Nanopartikel bieten eine vielversprechende Möglichkeit für die Krebstherapie und molekulare Baugruppen mit unterschiedlichen Funktionsgruppen Wirksamkeit von Medikamenten zu verbessern und reduzieren damit verbundenen Nebenwirkungen1,2. Darüber hinaus nutzen Nanopartikel Systeme vor allem passive und aktive targeting um Ziel Tumoren3zu erreichen.
Passive targeting nutzt die angeborenen Eigenschaften von Nanopartikeln und verbesserte Durchlässigkeit und Aufbewahrung (EPR) Effekte, Tumorzellen zu erreichen. Kationische Liposomen sind erfolgreich benutzt worden, Tumore in klinische Anwendungen4,5,6verschiedene Krebsmedikamente anzubieten. Trotz der potenziellen wirksam Krebs therapeutische Wirkung eine geringe Wirkstoffkonzentration in der tumorregion und der Unfähigkeit, Tumorzellen von normalen Zellen zu unterscheiden sind zwei wesentliche Einschränkungen des passiv-targeting Nanopartikel7.
Aktive targeting-Strategien nutzen Sie Antigen-Antikörper, Ligand-Rezeptor und andere molekulare Erkennung Interaktionen gezielt Medikamente an Tumoren8liefern. Plazentar Chondroitinsulfat Glykosaminoglykan (PlCSA) drückt sich im großen und ganzen auf die meisten Krebszellen und Plazenta Trophoblasten. Darüber hinaus können die Malaria Protein VAR2CSA speziell an PlCSA9,10binden. Daher kann VAR2CSA ein Werkzeug für das targeting von menschlichen Krebszellen sein. Wenn VAR2CSA mit Nanopartikeln konjugiert wird, kann das Full-Length Protein jedoch das Eindringen von Nanopartikeln in Tumorzellen einschränken. Kürzlich entdeckten wir eine PlCSA Bindung Peptid (PlCSA-BP), abgeleitet von der Malaria Protein VAR2CSA. PlCSA-BP-konjugiert Lipid-Polymer Nanopartikel rasch auf Choriocarcinoma Zellen und deutlich erhöhte Doxorubicin (DOX) Anti-Krebs-Aktivität in Vivo11gebunden; Diese Partikel auch speziell auf Plazenta Trophoblasten gebunden und als ein Instrument für die gezielte Abgabe von Medikamenten auf die Plazenta12dienen könnte.
Lipid-Polymer Nanopartikel bestehen aus einer Lipid-Monolayer-Shell und einer hydrophoben Polymeren Kern und repräsentieren einen neuen Träger für Drug-Delivery. Diese Nanopartikel verbinden die Vorteile von Liposomen und Polymeren darin, z. B. steuerbare nanopartikelgröße hohe Biokompatibilität, nachhaltiger Wirkstofffreisetzung, hohe Medikament laden Effizienz (LE) und ausgezeichnete Stabilität13. In dieser Arbeit haben wir eine einstufigen Beschallung Methode Lipid-Polymer Nanopartikel synthetisieren. Diese Methode ist schnell, bequem und Scale-up geeignet und ist am meisten benutzt Lipid-Polymer Nanopartikel Vorbereiten von unserer Gruppe11,14 u. a.15,16,17,18 .
1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) Carbodiimide Hydrochlorid (EDC) ist eine beliebte Carbodiimide als ein Vernetzungsmittel für Biomoleküle mit Aminen und Carboxylates19Konjugation verwendet. Neben EDC ist N-Hydroxysulfosuccinimide (NHS) das am weitesten verbreitete Konjugation Reagenz in Oberfläche und Nanopartikel Konjugation Reaktionen20,21. NHS kann reduzieren die Anzahl der Nebenreaktionen und verbessern die Stabilität und Ausbeute an Ester Zwischenprodukte22,23.
Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Synthese von PlCSA gezielt Lipid-Polymer Nanopartikel. Erstens wird die einstufigen Beschallung Synthese von DOX-geladene Lipid-Polymer-Nanopartikeln (DNPs) beschrieben. Dann wird eine EDC/NHS Bioconjugate Technik zur Erzeugung von PlCSA-BP-konjugiert Lipid-Polymer Nanopartikel eingeführt. Diese Bioconjugate Technik kann auch verwendet werden, andere Antikörper und Peptide mit Nanopartikeln zu konjugieren. Schließlich beschreiben wir die physikalisch-chemischen Eigenschaften und in-vitro- Assay verwendet, um die PlCSA ausgerichtete Lipid-Polymer Nanopartikel charakterisieren. Wir glauben, dass diese PlCSA gezielt Lipid-Polymer Nanopartikel ein effektives System für die gezielte Gabe von Medikamenten, um die meisten menschlichen Krebserkrankungen und die gezielte Bereitstellung von Nutzlasten der Plazenta zu plazentare Störungen zu behandeln sein könnte.
Dieses Protokoll bietet eine effiziente und reproduzierbare Methode zur Synthese von PlCSA-BP-konjugiert Lipid-Polymer Nanopartikel. Die einstufigen Beschallung Methode, Lipid-Polymer Nanopartikel vorzubereiten ist schnelle, reproduzierbare und unterscheidet sich von typischen Nanoprecipitation Methoden, die Heizung, aufschütteln oder Verdunstung betreffen. Die entwickelte Methode reduziert daher die Synthese-Zeit. Darüber hinaus ist die EDC/NHS Bioconjugate in diesem Protokoll verwendeten eine häufig gebrauchte und g…
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse vom National Key Research und Development Program of China (2016YFC1000402), der National Natural Sciences Foundation (81571445 und 81771617) und Natural Science Foundation der Provinz Guangdong (2016A030313178), unterstützt. X.F. und die Shenzhen Basic Research Fund (JCYJ20170413165233512), X.F.
plCSA peptide | Shanghai GL Biochem | 573518 | for peptide synthesis |
Ethanol absolute | Sinopharm Chemical | 10009218 | for nanoparticles synthesis |
Soybean lecithin | Avanti Polar Lipids | 441601 | for nanoparticles synthesis |
DSPE-PEG-COOH | Avanti Polar Lipids | 880125 | for nanoparticles synthesis |
Doxorubicin | JKChemical | 113424 | for nanoparticles synthesis |
Acetonitrile | Shanghai Lingfeng | 1008621 | for nanoparticles synthesis |
PLGA | Sigma-Aldrich | 719897 | for nanoparticles synthesis |
Ultrasonic processor | Sonics | VCX130 | for nanoparticles synthesis |
Centrifuge filter (MWCO 10 kDa) | Millipore | UFC801024 | for nanoparticles purification |
centrifuge | Sigma | 3-18KS | for nanoparticles purification |
2-[morpholino]ethanesulfonic acid(MES) | Sigma-Aldrich | M3671 | for peptide conjugation |
1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC) | Sigma-Aldrich | 3450 | for peptide conjugation |
N-hydroxysuccinimide (NHS) | Sigma-Aldrich | 56480 | for peptide conjugation |
Dialysis bags | Spectrum | 132592T | for nanoparticles purification |
PBS | Hyclone | SH30028.01 | for cell culture |
10 mL centrifuge tubes, polypropylene | Aladdin | S-025 | for nanoparticles synthesis |
15 mL centrifuge tubes, polypropylene | Corning | 430791 | for various applications |
0.22 μm sterile syringe filter | Millipore | SLGV033RB | for nanoparticles purification |
1 ml syringe, polypropylene | BD | 328421 | for nanoparticles synthesis |
Malvern Zetasizer | Malvern | Nano ZS | for particle size analyer |
Phosphotungstic acid | for TEM | ||
TEM grid | EMCN | BZ10024a | for TEM |
UV-VIS spectrometer | Leagene | DZ0035 | for TEM |
Transmission electron microscope |
JEOL | JEM-100CXII | for particle size analyer |
BCA reagent A | Thermo Fisher Scientific | 23228 | for BCA assay |
BCA reagent B | Thermo Fisher Scientific | 23224 | for BCA assay |
96-Well Plates | Corning | 3599 | for BCA assay |
Plate reader | Thermo Fisher Scientific | Multiskan™ GO | for BCA assay |
12-well plates | Corning | 3513 | for cell culture |
JEG3 cell | Cell Bank of the Chinese Academy of Sciences | TCHu195 | Human placenta |
DMEM/F12 | Hyclone | SH30272.01 | phenol red-free |
Fetal bovine serum (FBS) | GIBCO | 10100 | for cell culture |
Penicillin/streptomycin | GIBCO | 15070063 | for cell culture |
Fluorescence microscope | OLYMPUS | CKK53 | for celluar uptake |
Paraformaldehyde | Shanghai Lingfeng | 1372021 | for celluar uptake |
DAPI | Sangon Biotech | A606584 | for celluar uptake |
Mounting medium | Life | P36961 | for celluar uptake |