Следственный млекопитающих Axon регенерации: В Vivo электропорации взрослых мыши Спинной корень ганглия
Summary
Электропорация является эффективным подходом для доставки генов интересов в клетки. Применяя этот подход в естественных условиях на нейроны взрослых мыши корневой спинной ганглий (DRG), мы описываем модель для изучения регенерации аксона в естественных условиях.
Abstract
Электропорация является основных не вирусных генов трансфекции подход к внедрению ДНК плазмиды или малых молекул РНК в клетки. Сенсорного нейрона в корень спинной ганглий (ДРГ) расширяет один Аксон с двумя ответвлениями. Одна ветвь идет к периферической нерв (периферийные отделения) и другие отрасли входит спинного мозга через спинной корень (Центральный сектор). После нейронных травмы периферийное отделение надежно восстанавливает в то время как Центральный филиал не регенерировать. Из-за высокой регенеративной способностью сенсорные аксона регенерации широко использовался как модель системы для изучения млекопитающих аксона регенерации в периферической нервной системы (ПНС) и центральной нервной системы (ЦНС). Здесь мы описываем ранее установленных подход протокол манипулировать экспрессии генов в зрелых сенсорных нейронов в естественных условиях через электропорации. Основываясь на трансфекции плазмид или малых РНК oligos (малые интерферирующие РНК или микроРНК), подход позволяет для обоих – и получить из функция потерь экспериментов для изучения роли генов интересов или микроРНК в регуляции регенерации аксона в естественных условиях. Кроме того манипуляции ген выражение в естественных условиях может управляться в пространственном и временном отношении в течение относительно короткого времени курс. Эта модель система обеспечивает уникальный инструмент для изучения молекулярных механизмов, которыми регенерации аксона млекопитающих является регулируемой в естественных условиях.
Introduction
Травмы в нервной системе, вызванные нейронных травмы или различных нейродегенеративные заболевания обычно приводят в дефекты в моторные, сенсорные и когнитивные функции. Недавно много усилий была посвящена регенеративных потенции воссоздания в взрослых нейронов для восстановления физиологической functionsof ранения нейронов1,2,3. Сенсорные нейроны в DRG-группа нервных клеток, которые передают разные сенсорные стимулы, такие как боль, температура, touch или позы тела, мозг. Каждый из этих нейронов псевдо-однополярного и содержит один Аксон, который может разветвлять каждой присваивать с одной ветви, расширение к периферии и другая ветвь, направляясь в спинном4. Среди нескольких зрелых млекопитающих нейронов, известный регенерировать их аксоны активно после травмы взрослых сенсорных нейронов в ГДК. Следовательно травм сенсорные аксоны широко применялись как ключевую модель для изучения механизмов аксональное регенерации в vivo.
В естественных условиях Гене transfection методов, которые обычно меньше времени настроить и более гибким, чем при использовании трансгенных животных, играют важную роль в изучении функций генов и сигнальные пути в нервной системе. Основные методы могут быть разделены на два подхода: на основе документа и вирус5. Вирусные основанный в vivo гена доставки в взрослых нейронов может предоставить точные пространственно-временных манипуляции ген выражение6. Однако трудоемкие процессы участвуют в Вирусный на основе методов, например производства и очистки вирусных частиц, содержащий нужный ген. Кроме того многие вирусных векторов может активировать иммунную систему хозяина, который может повлиять на сбор данных, анализ данных и возможно заблуждение интерпретации экспериментальных результатов. Электропорация, типичный инструмент основе трансфекции подход, использует электрического импульса увеличить проницаемость клеток и ядерной мембраны временно, что способствует приток гена векторов или малых РНК oligos из пространства вне клетки7 . В vitro электропорации широко признается как временной, но весьма эффективные стратегии для манипулирования целевых генов выражение во многих типах клеток. Хотя в vivo электропорации приводит лишь к экспрессии генов переходные с низкой transfecting эффективности по сравнению с вирусных векторов, он имеет различные преимущества над вирусные подходы. Например он может применяться для почти всех тканей и клеток,7,8,9. Кроме того, либо плазмид, кодирование генов интерес или малые РНК oligos (например, малые интерферирующие РНК, микроРНК) против некоторых стенограммы можно непосредственно впрыскивается в ткани-мишени и затем электрически пульсирующий, которые делают процедуру меньше труда – и время – потребителями. Кроме того transfecting несколько плазмидов и РНК oligos одновременно с одной электропорации Возможен экспорт.
Мы создали в vivo электропорации подход к манипулировать экспрессии генов в взрослых мыши сенсорных нейронов и успешно применяется и проверки такой подход в многочисленных пионер исследований1,2,3 ,8,10. Здесь мы представляем подробный протокол для облегчения использования данного подхода для будущих исследований млекопитающих аксона регенерации.
Protocol
Representative Results
Discussion
Несколько хирургических шаги требуют особого внимания. L4 и L5 ГДК (местоположение СОСМ), которые доминируют седалищного нерва, должны быть правильно определены и вводят с Джин конструкции. В противном случае, будет отсутствовать GFP-маркировки в аксонов седалищного нерва. Подвздошные гре…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование финансировалось (вручается F-Q. З.), низ (R01NS064288, R01NS085176, R01GM111514, R01EY027347), Крейг H. Neilsen фонд и Фонд BrightFocus.
Materials
| ECM 830 Square wave electroporation system | BTX Harvard Apparatus | 45-0052 | For in vivo electroporation |
| Tweezertrodes electrodes | BTX Harvard Apparatus | 45-0524 | For in vivo electroporation, 1 mm flat |
| Picospritzer III | Parker Instrumentation | 1096 | Intracellular Microinjection Dispense Systems |
| Glass Capillary Puller | NARISHIGE | PC-10 | |
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments, Inc. | 1902328 | |
| Stereo Dissection Microscope | Leica | M80 | |
| Microsurgery Rongeur | F.S.T | 16221-14 | |
| Microsurgery Forceps | FST by DUMONT, Switzerland | 11255-20 | Only for sciatic nerve crush |
| Glass Capillary | World Precision Instruments, Inc. | TW100-4 | 10 cm, standard wall |
| Tape | Fisherbrand | 15-901-30 | For fixing the mouse on the corkboard |
| 2, 2, 2-Tribromoethanol (Avertin) | Sigma-Aldrich | T48402 | Avertin stock solution |
| 2-methyl-2-butanol | Sigma-Aldrich | 152463 | Avertin stock solution |
| siRNA Fluorescent Universal Negative Control #1 | Sigma-Aldrich | SIC003 | Non-target siRNA with fluorescence |
| microRNA Mimic Transfection Control with Dy547 | Dharmacon | CP-004500-01-05 | Non-target microRNA with fluorescence |
| Plasmids preparation kit | Invitrogen Purelink | K210016 | GFP-coding plasmid preparation |
| Fast Green Dye | Millipore-Sigma | F7252 | For better visualization of the DRG outline during injection |
| Ketamine | Putney, Inc | NDC 26637-731-51 | Anesthesia induction |
| Xylazine | AnaSed | NDC 59399-110-20 | Anesthesia induction |
| Acetaminophen | McNeil Consumer Healthcare | NDC 50580-449-36 | Post-surgical pain relief |
References
- Saijilafu, , et al. PI3K-GSK3 signalling regulates mammalian axon regeneration by inducing the expression of Smad1. Nature Communications. 4, 2690 (2013).
- Zhang, B. Y., et al. Akt-independent GSK3 inactivation downstream of PI3K signaling regulates mammalian axon regeneration. Biochemical and Biophysical Research Communications. 443 (2), 743-748 (2014).
- Jiang, J. J., et al. MicroRNA-26a supports mammalian axon regeneration in vivo by suppressing GSK3beta expression. Cell Death & Disease. 6, 1865 (2015).
- Krames, E. S. The role of the dorsal root ganglion in the development of neuropathic pain. Pain Medicine. 15 (10), 1669-1685 (2014).
- Salimzadeh, L., Jaberipour, M., Hosseini, A., Ghaderi, A. Non-viral transfection methods optimized for gene delivery to a lung cancer cell line. Avicenna Journal of Medical Biotechnology. 5 (2), 68-77 (2013).
- Keeler, A. M., ElMallah, M. K., Flotte, T. R. Gene Therapy 2017: Progress and Future Directions. Clinical and Translational Science. 10 (4), 242-248 (2017).
- Neumann, E., Schaeferridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. H. Gene-Transfer into Mouse Lyoma Cells by Electroporation in High Electric-Fields. The EMBO Journal. 1 (7), 841-845 (1982).
- Liu, C. M., et al. MicroRNA-138 and SIRT1 form a mutual negative feedback loop to regulate mammalian axon regeneration. Genes & Development. 27 (13), 1473-1483 (2013).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Developmental Biology. 240 (1), 237-246 (2001).
- Saijilafu, E. M., Hur, F. Q., Zhou, Genetic dissection of axon regeneration via in vivo electroporation of adult mouse sensory neurons. Nature Communications. 2, 543 (2011).
- Pan, C., et al. Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO. Nature Methods. 13, 859 (2016).
- Rao, R. D., Bagaria, V. B., Cooley, B. C. Posterolateral intertransverse lumbar fusion in a mouse model: surgical anatomy and operative technique. Spine Journal. 7 (1), 61-67 (2007).
- Dommisse, G. F. The blood supply of the spinal cord. A critical vascular zone in spinal surgery. The Journal of Bone and Joint Surgery. British Volume. 56 (2), 225-235 (1974).
- Sorensen, D. R., Leirdal, M., Sioud, M. Gene Silencing by Systemic Delivery of Synthetic siRNAs in Adult Mice. Journal of Molecular Biology. 327 (4), 761-766 (2003).
