Chargée de l’enquête la régénération axonale mammifères : In Vivo électroporation du Ganglion de la racine dorsale de souris adulte
Summary
Électroporation est une approche efficace pour livrer des gènes d’intérêts dans les cellules. En appliquant cette approche in vivo sur les neurones du ganglion de la racine dorsale de souris adulte (DRG), les auteurs décrivent un modèle pour l’étude de la régénération axonale in vivo.
Abstract
Électroporation est une approche de transfection du gène non viraux essentiel pour introduire des plasmides d’ADN ou de petites molécules d’ARN dans des cellules. Un neurone sensitif du ganglion de la racine dorsale (DRGs) s’étend d’un seul axone avec deux branches. Une branche va au périphérique nerf (branche périphérique) et l’autre branche pénètre dans la moelle épinière par l’intermédiaire de la racine dorsale (direction de la centrale). Après la lésion neurale, la branche périphérique régénère vigoureusement tandis que la branche centrale ne régénère pas. En raison de la forte capacité régénératrice, la régénération axonale sensorielle a été largement utilisée comme système modèle pour étudier la régénération axonale mammifères en système nerveux périphérique (SNP) et le système nerveux central (CNS). Nous décrivons ici un protocole approche établie antérieurement pour manipuler l’expression des gènes dans les neurones sensoriels matures in vivo par électroporation. Après transfection avec plasmides ou petits RNA oligos (siARN ou micro-ARN), l’approche permet les deux expériences de perte et de gain de-fonction d’étudier les rôles des gènes-de-intérêts ou de micro-ARN dans le règlement d’axon regeneration in vivo. En outre, la manipulation de l’expression génique in vivo peut être commandée spatialement et temporellement dans un cours laps de temps relativement court. Ce système de modèle fournit un outil unique pour étudier les mécanismes moléculaires par lesquels la régénération axonale mammifères est réglementé en vivo.
Introduction
Lésions du système nerveux provoquée par un traumatisme nerveux ou diverses maladies neurodégénératives généralement entraîner des défauts dans les fonctions motrices, sensorielles et cognitives. Récemment, beaucoup d’efforts a été consacré à la restitutio in integrum puissance régénératrice dans les neurones adultes pour restaurer les statuts physiologique blessé neurones1,2,3. Les neurones sensoriels dans le PMSI sont un amas de cellules nerveuses qui transmettent les stimuli sensoriels différents, tels que douleur, température, touch ou posture du corps, le cerveau. Chacun de ces neurones est Pseudo-aléatoire unipolaire et contient un seul axone qui bifurque avec une branche qui s’étend vers la périphérie et l’autre branche vers la moelle épinière4. Les neurones sensoriels adultes en GHM sont parmi les quelques neurones mammifères matures connues pour régénérer leurs axones activement après une blessure. Par conséquent, lésions des axones sensoriels ont été employées intensivement comme un modèle crucial pour étudier les mécanismes de la régénération axonale in vivo.
In vivo techniques de transfection génétique, qui sont généralement moins de temps à mettre en place et plus souple que l’utilisation d’animaux transgéniques, ont joué un rôle essentiel dans l’étude des fonctions des gènes et signalisation dans le système nerveux. Les principales techniques peuvent être classés en deux approches : la5axée sur l’instrument et la base de virus. Base virale in vivo la livraison de gène dans les neurones adultes peut fournir précise manipulation spatio-temporelle de gene expression6. Cependant, beaucoup de travail processus interviennent dans les méthodes axées sur le viral, tels que la production et la purification des particules virales contenant le gène désiré. En outre, beaucoup de vecteurs viraux pourrait activer le système immunitaire de l’hôte, qui peut interférer avec l’acquisition de données, analyse de données et éventuellement induire en erreur l’interprétation des résultats expérimentaux. Électroporation, une approche axée sur l’instrument typique de la transfection, utilise une impulsion électrique pour augmenter la perméabilité des cellules et des membranes nucléaires transitoirement, ce qui favorise l’afflux de vecteurs de gènes ou de petits RNA oligos depuis l’espace à l’extérieur des cellules7 . In vitro électroporation est largement reconnue comme une stratégie transitoire mais très efficace pour manipuler l’expression des gènes ciblés dans plusieurs types de cellules. Bien que en vivo électroporation ne conduit qu’à l’expression transitoire avec la faible efficacité de transfection par rapport aux vecteurs viraux, il a plusieurs avantages par rapport aux approches virales. Par exemple, il peut être appliqué à presque tous les tissus et cellules7,8,9. En outre, deux plasmides codant des gènes d’intérêt ou petits RNA oligos (p. ex., siRNAs, microARN) contre certaines transcriptions peuvent être injectés directement dans le tissu cible et puis électrique pulsés, qui rendre la procédure moins du travail – et temps – consommer. En outre, il est possible de transfectants plusieurs plasmides et RNA oligos simultanément avec l’électroporation unique.
Nous avons établi une démarche d’électroporation in vivo pour manipuler l’expression des gènes dans les neurones sensoriels de souris adultes et appliquée avec succès et validé cette approche dans nombreuses études pionnières1,2,3 ,8,10. Nous présentons ici un protocole détaillé afin de faciliter l’utilisation de cette approche pour les études futures de la régénération axonale chez les mammifères.
Protocol
Representative Results
Discussion
Plusieurs étapes chirurgicales nécessitent une attention particulière. Le L4 et L5 DRGs (emplacement de somas), qui dominent le nerf sciatique, doivent être correctement identifiés et une injection de gènes chimères. Dans le cas contraire, la GFP-étiquetage seront absent dans les axones du nerf sciatique. Les crêtes iliaques peuvent considérer comme des repères anatomiques utiles pour déterminer des L4 et L5 DRGs. Dans la plupart des souris, la facette conjointe entre les vertèbres L5 et L6 est proche de cel…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
L’étude a été financée (décernée à F-Q. Z.) par les NIH (R01NS085176, R01GM111514, R01NS064288, R01EY027347), the Craig H. Neilsen Foundation et la Fondation BrightFocus.
Materials
| ECM 830 Square wave electroporation system | BTX Harvard Apparatus | 45-0052 | For in vivo electroporation |
| Tweezertrodes electrodes | BTX Harvard Apparatus | 45-0524 | For in vivo electroporation, 1 mm flat |
| Picospritzer III | Parker Instrumentation | 1096 | Intracellular Microinjection Dispense Systems |
| Glass Capillary Puller | NARISHIGE | PC-10 | |
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments, Inc. | 1902328 | |
| Stereo Dissection Microscope | Leica | M80 | |
| Microsurgery Rongeur | F.S.T | 16221-14 | |
| Microsurgery Forceps | FST by DUMONT, Switzerland | 11255-20 | Only for sciatic nerve crush |
| Glass Capillary | World Precision Instruments, Inc. | TW100-4 | 10 cm, standard wall |
| Tape | Fisherbrand | 15-901-30 | For fixing the mouse on the corkboard |
| 2, 2, 2-Tribromoethanol (Avertin) | Sigma-Aldrich | T48402 | Avertin stock solution |
| 2-methyl-2-butanol | Sigma-Aldrich | 152463 | Avertin stock solution |
| siRNA Fluorescent Universal Negative Control #1 | Sigma-Aldrich | SIC003 | Non-target siRNA with fluorescence |
| microRNA Mimic Transfection Control with Dy547 | Dharmacon | CP-004500-01-05 | Non-target microRNA with fluorescence |
| Plasmids preparation kit | Invitrogen Purelink | K210016 | GFP-coding plasmid preparation |
| Fast Green Dye | Millipore-Sigma | F7252 | For better visualization of the DRG outline during injection |
| Ketamine | Putney, Inc | NDC 26637-731-51 | Anesthesia induction |
| Xylazine | AnaSed | NDC 59399-110-20 | Anesthesia induction |
| Acetaminophen | McNeil Consumer Healthcare | NDC 50580-449-36 | Post-surgical pain relief |
References
- Saijilafu, , et al. PI3K-GSK3 signalling regulates mammalian axon regeneration by inducing the expression of Smad1. Nature Communications. 4, 2690 (2013).
- Zhang, B. Y., et al. Akt-independent GSK3 inactivation downstream of PI3K signaling regulates mammalian axon regeneration. Biochemical and Biophysical Research Communications. 443 (2), 743-748 (2014).
- Jiang, J. J., et al. MicroRNA-26a supports mammalian axon regeneration in vivo by suppressing GSK3beta expression. Cell Death & Disease. 6, 1865 (2015).
- Krames, E. S. The role of the dorsal root ganglion in the development of neuropathic pain. Pain Medicine. 15 (10), 1669-1685 (2014).
- Salimzadeh, L., Jaberipour, M., Hosseini, A., Ghaderi, A. Non-viral transfection methods optimized for gene delivery to a lung cancer cell line. Avicenna Journal of Medical Biotechnology. 5 (2), 68-77 (2013).
- Keeler, A. M., ElMallah, M. K., Flotte, T. R. Gene Therapy 2017: Progress and Future Directions. Clinical and Translational Science. 10 (4), 242-248 (2017).
- Neumann, E., Schaeferridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. H. Gene-Transfer into Mouse Lyoma Cells by Electroporation in High Electric-Fields. The EMBO Journal. 1 (7), 841-845 (1982).
- Liu, C. M., et al. MicroRNA-138 and SIRT1 form a mutual negative feedback loop to regulate mammalian axon regeneration. Genes & Development. 27 (13), 1473-1483 (2013).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Developmental Biology. 240 (1), 237-246 (2001).
- Saijilafu, E. M., Hur, F. Q., Zhou, Genetic dissection of axon regeneration via in vivo electroporation of adult mouse sensory neurons. Nature Communications. 2, 543 (2011).
- Pan, C., et al. Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO. Nature Methods. 13, 859 (2016).
- Rao, R. D., Bagaria, V. B., Cooley, B. C. Posterolateral intertransverse lumbar fusion in a mouse model: surgical anatomy and operative technique. Spine Journal. 7 (1), 61-67 (2007).
- Dommisse, G. F. The blood supply of the spinal cord. A critical vascular zone in spinal surgery. The Journal of Bone and Joint Surgery. British Volume. 56 (2), 225-235 (1974).
- Sorensen, D. R., Leirdal, M., Sioud, M. Gene Silencing by Systemic Delivery of Synthetic siRNAs in Adult Mice. Journal of Molecular Biology. 327 (4), 761-766 (2003).
