Inquirenti rigenerazione dell'assone dei mammiferi: In Vivo elettroporazione del ganglio di radice dorsale del topo adulto
Summary
L’elettroporazione è un approccio efficace per trasportare geni degli interessi nelle cellule. Applicando questo approccio in vivo sui neuroni del ganglio di topo adulto radice dorsale (DRG), descriviamo un modello per lo studio di rigenerazione dell’assone in vivo.
Abstract
L’elettroporazione è un approccio di transfezione genica non-virale essenziale per introdurre DNA plasmidi o piccole molecole di RNA nelle cellule. Un neurone sensoriale nel ganglio di radice dorsale (DRG) si estende un singolo assone con due rami. Un ramo va alla periferica e l’altro ramo del nervo (ramo periferico) entra nel midollo spinale attraverso la radice dorsale (sede centrale). Dopo la ferita neurale, il ramo periferico rigenera robustamente considerando che il ramo centrale non si rigenerano. A causa della alta capacità rigenerativa, rigenerazione degli assoni sensoriali è stato ampiamente utilizzata come sistema modello per studiare la rigenerazione assonale dei mammiferi in sia il sistema nervoso periferico (PNS) e sistema nervoso centrale (SNC). Qui, descriviamo un protocollo di approccio precedentemente stabilito per modificare l’espressione genica nei neuroni sensoriali maturi in vivo tramite elettroporazione. L’approccio basato su transfezione con plasmidi o piccoli RNA oligos (siRNA o microRNA), consente entrambi gli esperimenti di perdita e guadagno di funzione di studiare il ruolo di geni di interesse o microRNA nella regolazione dell’assone rigenerazione in vivo. Inoltre, la manipolazione dell’espressione genica in vivo può essere controllata sia spazialmente e temporalmente all’interno di un corso di tempo relativamente breve. Questo sistema modello fornisce uno strumento unico per studiare i meccanismi molecolari con cui rigenerazione dell’assone dei mammiferi è regolamentato in vivo.
Introduction
Lesioni nel sistema nervoso causati da traumi neurali o varie malattie neurodegenerative di solito provocano difetti nelle funzioni motorie, sensoriali e cognitive. Recentemente, molto sforzo è stato dedicato al ristabilimento di potenza rigenerativa in neuroni adulti per ripristinare la fisiologica PCM feriti neuroni1,2,3. Neuroni sensoriali nel DRG sono un gruppo di cellule nervose che trasmettono gli stimoli sensoriali differenti, come dolore, temperatura, tocco o la postura del corpo, al cervello. Ciascuno di questi neuroni è pseudo-unipolare e contiene un singolo assone che moltiplica con un ramo che si estende verso la periferia e l’altro ramo andando verso il midollo spinale4. I neuroni sensoriali adulti in DRGs sono tra i pochi neuroni maturi dei mammiferi, noti per rigenerare i loro assoni attivamente dopo la ferita. Quindi, lesioni di assoni sensoriali sono state ampiamente impiegate come un modello fondamentale per studiare i meccanismi di rigenerazione assonale in vivo.
In vivo tecniche transfezione genica, che sono solitamente meno laborioso da configurare e più flessibile rispetto all’utilizzo di animali transgenici, hanno giocato ruoli essenziali nello studio le funzioni dei geni e vie nel sistema nervoso di segnalazione. Le tecniche principali possono essere classificate in due approcci: basati su virus e strumento5. Basato su virale in vivo gene consegna in neuroni adulti può fornire spatiotemporal precisa manipolazione del gene espressione6. Tuttavia, processi di lavoro ad alta intensità sono coinvolti in metodi basati su virali, quali la produzione e purificazione di particelle virali che contiene il gene desiderato. Inoltre, molti vettori virali potrebbero attivare il sistema immunitario dell’ospite, che può interferire con l’acquisizione di dati, analisi dei dati ed eventualmente indurre in errore l’interpretazione dei risultati sperimentali. Elettroporazione, un approccio tipico strumento-basato transfezione, utilizza un impulso elettrico per aumentare la permeabilità delle cellule e delle membrane nucleari transitoriamente, che favorisce l’afflusso di gene vettori o piccoli RNA oligos dallo spazio di fuori delle cellule7 . In vitro l’elettroporazione è ampiamente riconosciuto come una strategia transitoria ma altamente efficiente per la manipolazione genica mirata in molti tipi cellulari. Sebbene in vivo elettroporazione porta solo all’espressione genica transitoria a bassa efficienza di trasfezione rispetto ai vettori virali, ha diversi vantaggi rispetto ad approcci virali. Per esempio, può essere applicato a quasi tutti i tessuti e le cellule7,8,9. Inoltre, entrambi plasmidi codifica geni di interesse o piccoli RNA oligos (ad es., siRNA, microRNA) contro alcune trascrizioni possono essere iniettati direttamente nel tessuto dell’obiettivo e quindi elettricamente pulsate, che rendono la procedura meno manodopera – e tempo che consumano. Inoltre, la trasfezione più plasmidi e RNA oligos simultaneamente con elettroporazione singolo è possibile.
Abbiamo istituito un approccio in vivo elettroporazione per manipolare l’espressione genica nei neuroni sensoriali topo adulto e applicato con successo e convalidato tale approccio in numerosi studi pioneer1,2,3 ,8,10. Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per facilitare l’utilizzo di questo approccio per gli studi futuri di rigenerazione degli assoni dei mammiferi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Diverse fasi chirurgiche richiedono particolare attenzione. La L4 e L5 DRGs (posizione di somas), che dominano il nervo sciatico, devono essere correttamente identificati e iniettato con costrutti genici. In caso contrario, la GFP-etichettatura sarà assente negli assoni del nervo sciatico. Le creste iliache possono essere visualizzate come punti di riferimento anatomici utili per individuare L4 e L5 DRGs. Nella maggior parte dei topi, il giunto tra le vertebre L5 e L6 di sfaccettatura è prossima a creste iliache<sup cl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Lo studio è stato finanziato (assegnato a F-Q. Z) di NIH (R01NS064288, R01NS085176, R01GM111514, R01EY027347), la Fondazione di Neilsen H. Craig e la Fondazione di BrightFocus.
Materials
| ECM 830 Square wave electroporation system | BTX Harvard Apparatus | 45-0052 | For in vivo electroporation |
| Tweezertrodes electrodes | BTX Harvard Apparatus | 45-0524 | For in vivo electroporation, 1 mm flat |
| Picospritzer III | Parker Instrumentation | 1096 | Intracellular Microinjection Dispense Systems |
| Glass Capillary Puller | NARISHIGE | PC-10 | |
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments, Inc. | 1902328 | |
| Stereo Dissection Microscope | Leica | M80 | |
| Microsurgery Rongeur | F.S.T | 16221-14 | |
| Microsurgery Forceps | FST by DUMONT, Switzerland | 11255-20 | Only for sciatic nerve crush |
| Glass Capillary | World Precision Instruments, Inc. | TW100-4 | 10 cm, standard wall |
| Tape | Fisherbrand | 15-901-30 | For fixing the mouse on the corkboard |
| 2, 2, 2-Tribromoethanol (Avertin) | Sigma-Aldrich | T48402 | Avertin stock solution |
| 2-methyl-2-butanol | Sigma-Aldrich | 152463 | Avertin stock solution |
| siRNA Fluorescent Universal Negative Control #1 | Sigma-Aldrich | SIC003 | Non-target siRNA with fluorescence |
| microRNA Mimic Transfection Control with Dy547 | Dharmacon | CP-004500-01-05 | Non-target microRNA with fluorescence |
| Plasmids preparation kit | Invitrogen Purelink | K210016 | GFP-coding plasmid preparation |
| Fast Green Dye | Millipore-Sigma | F7252 | For better visualization of the DRG outline during injection |
| Ketamine | Putney, Inc | NDC 26637-731-51 | Anesthesia induction |
| Xylazine | AnaSed | NDC 59399-110-20 | Anesthesia induction |
| Acetaminophen | McNeil Consumer Healthcare | NDC 50580-449-36 | Post-surgical pain relief |
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