Summary

Isolamento e identificação de células do sistema imunológico Extravascular do coração

Published: August 23, 2018
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Summary

Este protocolo apresenta um método simples e eficiente de isolar, identificar e quantificar as células imunes que residem no miocárdio de ratos durante o estado estacionário ou inflamação. O protocolo combina digestão enzimática e mecânica para a geração de uma suspensão de célula única que pode ser mais analisada por citometria de fluxo.

Abstract

O sistema imunológico é um componente essencial de um coração saudável. O miocárdio é lar de uma população rica de subconjuntos de células imunes diferentes com compartimentalização funcional tanto durante o estado estacionário e diferentes formas de inflamação. Até recentemente, o estudo de células do sistema imunológico no coração exigido o uso da microscopia ou protocolos de digestão mal desenvolvidos, que forneceu suficiente sensibilidade durante inflamação grave, mas com confiança não foram capazes de identificam pequenas — mas chave — populações de células durante o estado estacionário. Aqui, vamos discutir um método simples que combina enzimática (colagenase, hialuronidase e DNAse) e digestão mecânica de corações murino precedidas pela administração intravascular de fluorescente etiquetado anticorpos para diferenciar pequenas mas inevitável contaminantes de célula intravascular. Este método gera uma suspensão de células viáveis isoladas que podem ser analisados por citometria de fluxo para identificação, fenotipagem e quantificação, ou ainda mais purificado com fluorescência-ativado da pilha classificação ou separação magnética do grânulo para estudos de análise ou em vitro transcricionais. Nós incluímos um exemplo de uma análise de cytometric do fluxo passo a passo para diferenciar o macrófago chave e populações de células dendríticas do coração. Para uma experiência de tamanho média (10 corações) a conclusão do procedimento requer 2 a 3 h.

Introduction

Diferentes formas de stress do miocárdio ou acidentes, inclusive isquêmica (reperfusão de isquemia ou infarto do miocárdio) e não-isquêmica (hipertensão ou miocardite), promover o recrutamento de células inflamatórias com reparadora e protetora, mas também Propriedades de patogenicidade. Logo em 1891, Romberg descrita pela primeira vez a presença de celulares se infiltra no miocárdio de pacientes infectados com tifo e febre escarlatina1. No entanto, o estudo detalhado de células do sistema imunológico cardíacas necessária ao desenvolvimento de técnicas mais avançadas de immunophenotyping. Como consequência, somente recentemente nós começaram a entender que uma população diversa de células do sistema imunológico com funções essenciais de manutenção durante o estado estacionário reside dentro do miocárdio.

Histologia tem sido e ainda é, o método mais comum para caracterizar pilhas imunes cardíacas durante a inflamação. No entanto, enquanto histologia representa uma valiosa ferramenta de diagnóstico, sua utilização no estudo de células do sistema imunológico cardíacas tem limitações importantes. As células imunitárias que residem no miocárdio representam uma proporção muito pequena das células totais e são mais ou menos uniformemente distribuídas em um espaço proporcionalmente imenso. Da mesma forma, várias formas de inflamação cardíaca, tais como miocardite viral, apresentam padrões focais de inflamação. Isto significa que uma análise precisa do sistema imunológico do coração muitas vezes exige graus mais elevados de amostragem histológica, aumentando o custo para reduzir o preconceito. Além disso, a histologia fornece uma quantidade muito limitada de informações utilizáveis na identificação de células (por exemplo, o número de parâmetros). Com um número sempre crescente de subconjuntos de célula que exigem o uso de vários marcadores de expressão (incluindo os marcadores de superfície, fatores de transcrição ou moléculas secretadas), citometria de fluxo estabeleceu-se como a ferramenta mais poderosa para immunophenotyping, devido ao baixo custo e alta produtividade.

O uso de técnicas de immunophenotyping é estreitamente dependente do desenvolvimento de protocolos de digestão eficiente que permitiu para análise de single-células de um grande número de células. O desenvolvimento de protocolos exaustivos de extração de célula aberta uma nova janela de oportunidades no estudo da imunologia cardíaca. Através da combinação de digestão, citometria de fluxo e transcriptomics, as grandes populações de macrófagos e células dendríticas, que reside no coração foram caracterizadas2,3. A população mais abundante de células do sistema imunológico cardíacas durante estado estacionário são CD64+MerTK+ macrófagos, que podem ser divididos com base na sua expressão de CCR2 ou CD11c2. CCR2+ macrófagos originam hematopoiese adulta da medula óssea, Considerando que a maioria dos CCR2 macrófagos, que podem expressar os níveis de altos ou baixos de MHC-II, são principalmente de origem pré-natal. Os macrófagos funções chave como reparo4 e remoção de detritos5 durante lesão ou suportando conectividade elétrica6 em estado estacionário. Durante diferentes formas de inflamação ocorrer um afluxo importante de Ly6COi MHC-IIEis CD64int monócitos, que mais tarde se diferenciar em Ly6COi CCR2+ macrófagos2,7 . Uma população significativamente menor, mas importante, de células que residem no miocárdio de indivíduos saudáveis é composta de células dendríticas8,9. Recentemente foram caracterizados os dois subconjuntos principais de DCs convencionais cardíacas (conjuntos): cDC1 (CD103+ DCs) e cDC2 (CD11b+ DCs). DCs desempenham um papel importante na defesa contra infecção8 mas também podem promover a auto-lesão durante a inflamação, particularmente durante o infarto do miocárdio9.

Aqui, descrevemos um método simples para o isolamento das células imunes cardíacas viáveis de miocárdio de rato. O método combina digestão enzimática e mecânica com uma filtração de célula-filtro para obter uma suspensão de célula única que pode ser analisada, ou ainda mais purificada, pela classificação de citometria de fluxo ou enriquecimento magnética do grânulo. Medições precisas de células do miocárdio extravascular necessitam de perfusão cardíaca para remover possíveis contaminantes da corrente sanguínea da microvasculatura cardíaca. Além disso, apresentamos um passo opcional de rotulagem intravascular de células do sistema imunológico que podem ser usadas para diferenciar ainda mais as células do miocárdio de contaminantes intravasculares, com base no protocolo et al Galkina10. Finalmente, apresentamos uma análise de citometria de fluxo básico para identificar as principais subpopulações de macrófagos e cDC.

Protocol

Declaração de ética: Este protocolo foi revisado e aprovado pelo Comitê de cuidado Animal na rede de saúde da Universidade (Toronto, Canadá) e está em conformidade com o Conselho canadense no cuidado Animal. 1. preparação buffer Prepare o tampão HBB (Hank está equilibrado sal solução (HBSS), soro bovino de calor 2% inactivada, 0,2% de albumina de soro bovino). Adicione 10 mL de calor inativada soro bovino e 1 g de albumina de soro bovino de 500 mL de HBSS. Filtro de este…

Representative Results

Até à data, nenhum bom método foi projetado para isolar as células imunes de outros componentes da célula cardíaca, tais como cardiomyocytes. Portanto, análise da suspensão por citometria de fluxo cardíaco única célula requer um pre-gating com CD45 para identificar as populações de células imunes, seguidas por uma única célula e tamanho pequeno exclusão associada (Figura 1A). Alternativamente, uma coloração de viabilidade p…

Discussion

Inflamação do miocárdio ou miocardite, é uma característica das doenças cardiovasculares mais. No entanto, o miocárdio não é desprovida de seus próprios componentes imunes nos Estados de não-doença. Durante o estado estacionário, muitas células do sistema imunológico residem no miocárdio e desempenham o papel essencial de manutenção e proteção. A caracterização dessas diversas populações de células não teria sido possível sem métodos como o apresentado neste protocolo.

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Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado pelo canadense institutos de pesquisa em saúde (148808 e 148792), SE foi apoiado por um coração e Stroke Foundation, o prêmio do pessoal do escritório Provincial de Ontário, March of Dimes, Ted Rogers Centre para a investigação de coração e o Peter Munk Centro cardíaco. Xavier possui um CIHR Banting Fellowship. LA tem um coração & Stroke/Richard Lewar Studentship Award.

Materials

Phosphate buffered saline Wisent 311-010-CL 1x PBS
21Gx 1 1/2 (0.8mmx40mm) PrecisionGlide Needle BD 305167
Hank’s Balanced Salt Solution Wisent 311-511-CL 1x HBSS
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A4503-50G
Bovine serum Sigma B9433
0.5M Ethylenediaminetetraacetic acid BioShop EDT111
Vacuum filter , 0.2 µm Filtropur V50 Sarstedt 83.1823.001
28G 1/2 1 cc insulin syringe BD 329424
60 mL syringe BD 309653
Dulbecco's Modified Eagle Medium Wisent 319-005-CL 1x DMEM with 4.5 g/L glucose and L-Glutamine and Sodium Pyruvate
Collagenase I Sigma C0130 from Clostridium histolyticum
Hyaluronidase type I-S Sigma H3506
DNase-I Sigma D4513 from bovine pancreas
Cell strainer, 40 µm Nylon Falcon 352340
Ammonium-Chloride- Potassium (ACK) lysis buffer Lonza 10-546E
Alexa Fluor 700 anti-mouse/human CD11b Biolegend 101222 1:250 dilution
APC/Cy7 anti-mouse Ly-6c Biolegend 128025 1:250 dilution
APC anti-mouse CD103 Biolegend 121414 1:250 dilution
Brilliant Violet 605 anti-mouse CD11c Biolegend 117334 1:250 dilution
PE anti-mouse Ly-6G Biolegend 127607 1:250 dilution
Pacific Blue anti-mouse I-Ab Biolegend 116422 1:250 dilution
FITC anti-mouse CD64 (FcgRI) Biolegend 139315 1:250 dilution
PE/Cy7 anti-mouse CD45 Biolegend 103113 1:250 dilution
PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD45 Biolegend 103132 1:40 dilution
TruStain fcX (anti-mouse CD16/32) Biolegend 101320 1:100 dilution
True-Stain Monocyte Blocker Biolegend 426101 1:20 dilution
FlowJo V10 TreeStar Inc https://www.flowjo.com/solutions/flowjo
Mouse: Batf3-/- The Jackson Laboratory JAX: 013755

References

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Cite This Article
Aronoff, L., Epelman, S., Clemente-Casares, X. Isolation and Identification of Extravascular Immune Cells of the Heart. J. Vis. Exp. (138), e58114, doi:10.3791/58114 (2018).

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