בידוד וזיהוי של תאים חיסוניים Extravascular של הלב
Summary
פרוטוקול זה מציג שיטה פשוטה ויעילה כדי לבודד, לזהות ולכמת תאים חיסוניים המתגוררים במהלך מצב יציב או דלקת שריר הלב של עכברים. הפרוטוקול משלב עיכול אנזימטי ועל מכניים לדור של השעיה תא בודד מסוגל לנתח עוד יותר על ידי cytometry זרימה.
Abstract
המערכת החיסונית היא מרכיב חיוני של לב בריא. שריר הלב הוא ביתם של אוכלוסיה עשירה של תאים חיסוניים שונים תת-ערכות עם תפקודי מידור במהלך מצב יציב ובמהלך צורות שונות של דלקת. עד לאחרונה, המחקר של תאים חיסוניים בלב הצריכו השימוש במיקרוסקופ או פרוטוקולים עיכול לקוי מפותחת, אשר סיפקה מספיק רגישות בזמן דלקת חמורה אבל לא היו מסוגלים בביטחון לזהות קטן — אבל מפתח – אוכלוסיות של תאים במהלך מצב יציב. כאן נדון שילוב של שיטה פשוטה אנזימטי (collagenase, hyaluronidase ו- DNAse) ועיכול מכני מאתר לבבות ולפניהם קרישה תוך-כלית מינהל מתויג fluorescently נוגדנים להבדיל קטן אבל בלתי נמנע קרישה תוך-כלית תא מזהמים. שיטה זו יוצרת השעיה של מבודד התאים קיימא שניתן נותחו על ידי cytometry זרימה עבור phenotyping וכימות, או מטוהרים נוסף עם תא לפעיל על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיון או הפרדה מגנטית חרוז לימודי ניתוח או במבחנה תעתיק. אנו כוללים דוגמה של ניתוח cytometric זרימה צעד אחר צעד כדי להבדיל בין מקרופאג מפתח אוכלוסיות תאים דנדריטים של הלב. עבור ניסוי בגודל בינוני (10 לבבות) השלמת ההליך מחייב h 2-3.
Introduction
צורות שונות של מתח שריר הלב או פציעה, כולל איסכמי (פגיעה reperfusion איסכמיה או אוטם שריר הלב) ואיסכמי (יתר לחץ דם או דלקת שריר הלב), לקדם הגיוס של תאים דלקתיים עם תיקוני ומגונן, אבל גם מאפייני פתוגניים. מוקדם ככל 1891, רומברג תיאר לראשונה את הנוכחות של תסנין התאית בשריר של חולים שנדבקו עם טיפוס ועוד השנית1. עם זאת, המחקר מפורט של תאים חיסוניים לב נדרש הפיתוח של טכניקות מתקדמות יותר immunophenotyping. כתוצאה מכך, רק לאחרונה התחלנו להבין כי אוכלוסיה מגוונת של תאים חיסוניים עם תחזוקה חיוני תפקידים במהלך מצב יציב שוכן בתוך שריר הלב.
היסטולוגיה היה, והוא עדיין, השיטה הנפוצה ביותר כדי לאפיין את תאי מערכת החיסון לב בעת דלקת. עם זאת, בעוד היסטולוגיה מייצג כלי אבחוני חשוב, השימוש במחקר של תאי מערכת החיסון לב יש מגבלות חשוב. תאים חיסוניים המתגוררים שריר הלב מייצג חלק קטן מאוד של התאים הכולל ומופצים פחות או יותר באופן שווה בחלל העצום באופן פרופורציונלי. באופן דומה, כמה צורות של דלקת לב, כגון נגיפי דלקת שריר הלב, להציג דפוסים מוקד של דלקת. משמעות הדבר היא כי ניתוח מדויק של המערכת החיסונית של הלב דורשים לעיתים קרובות גבוהה יותר מעלות של דגימה היסטולוגית, הגדלת העלות לצמצם הטיה. יתר על כן, היסטולוגיה מספק כמות מוגבלת מאוד של מידע שימושי בזיהוי תא (למשל מספר פרמטרים). עם מספר גדל והולך של תת-ערכות תא מחייבות השימוש של מספר סמני ביטוי (כולל סמני פני השטח, גורמי שעתוק או על ידי מולקולות), cytometry זרימה ביססה את עצמה בתור הכלי החזק ביותר עבור immunophenotyping, בשל בעלות נמוכה, תפוקה גבוהה.
השימוש בטכניקות immunophenotyping תלויה בשיתוף פעולה הדוק לפיתוח פרוטוקולים לעיכול יעיל המותר עבור ניתוח חד-תאים של מספר גדול של תאים. הפיתוח של הפרוטוקולים ממצה של מיצוי תא נפתח חלון חדש של הזדמנויות במחקר של הלב אימונולוגיה. באמצעות השילוב של מערכת העיכול, cytometry זרימה transcriptomics, האוכלוסיות הגדולות של מקרופאגים, תאים דנדריטים ששוכן בלב היה מאופיין2,3. האוכלוסייה הנפוץ ביותר של תאים חיסוניים הלב במהלך מצב יציב הן CD64+MerTK+ מקרופאגים, אשר ניתן לחלק נוספת המבוססת על הבעת רגשותיהם CCR2 או CD11c2. CCR2+ מקרופאגים שמקורם במח העצם למבוגרים hematopoiesis, בעוד הרוב המכריע של CCR2– מקרופאגים, אשר יכולים לבטא רמות גבוה או נמוך של MHC-II, הם בעיקר ממוצא טרום לידתי. מקרופאגים לבצע פונקציות מפתח כגון תיקון4 ופינוי פסולת5 במהלך פציעה או תמיכה קישוריות חשמלי6 במצב יציב. במהלך צורות שונות של דלקת זרם חשוב של Ly6Cשלום MHC-IIהלאו CD64int ומונוציטים להתרחש, אשר מאוחר יותר להבדיל לתוך Ly6Cשלום CCR2+ מקרופאגים2,7 . אוכלוסיה קטנה יותר באופן משמעותי, אבל חשוב, של תאים המתגוררים שריר הלב של אנשים בריאים מורכב של תאים דנדריטים8,9. שני תת-קבוצות העיקריים של הלב בקרי קבוצת מחשבים קונבנציונלי (cDCs) אפיינו היה לאחרונה: cDC1 (CD103+ DCs), cDC2 (CD11b+ בקרי קבוצת מחשבים). DCs לשחק תפקידים חשובים בהגנה נגד זיהום8 , אך יכול גם לקדם פגיעה עצמית בעת דלקת, במיוחד במהלך אוטם שריר הלב9.
כאן, אנו מתארים שיטה פשוטה עבור בידוד של קיימא תאים חיסוניים הלב מן העכבר שריר הלב. השיטה משלבת עיכול אנזימטי ועל מכניים עם סינון תא-מסננת כדי לקבל השעיה תא בודד שניתן לנתח, או עוד יותר טהור, על ידי מיון cytometry זרימה או חרוז מגנטי העשרה. מדידות מדויקות של תאי שריר הלב extravascular דורשות זלוף הלב כדי להסרת לכלוך אפשרי מזרם הדם של microvasculature הלב. בנוסף, אנו מציגים שלב אופציונלי של קרישה תוך-כלית תיוג של תאים חיסוניים יכול לשמש כדי נוספות להבדיל תאי שריר הלב מזהמים קרישה תוך-כלית, המבוסס על פרוטוקול et al. Galkina10. לבסוף, אנו מציגים ניתוח cytometry זרימה בסיסיים כדי לזהות את subpopulations הגדולות מקרופאג ו- cDC.
Protocol
Representative Results
Discussion
דלקת שריר הלב, או דלקת שריר הלב, היא תכונה של מחלות לב וכלי דם ביותר. עם זאת, שריר הלב אינו נטול משלו רכיבי מערכת החיסון במצבים שאינם מחלת. במהלך מצב יציב, תאים חיסוניים רבים שוכנים בשריר, לגלם את התפקידים החיוניים של תחזוקה והגנה. אפיון אלה אוכלוסיות מגוונות של תאים לא היה אפשרי ללא שיטות כמו…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי קנדי מוסדות של בריאות המחקר (148808 ו- 148792), SE נתמכה על ידי הלב ושבץ קרן, פרס אנשי משרד מחוזי אונטריו, המשפחה, טד רוג’רס מרכז הלב ומחקר של מונק פיטר מרכז הלב. XCC מחזיקה מלגת בנטינג CIHR. LA מחזיקה של הלב & קו/ריצ’רד Lewar Studentship פרס.
Materials
| Phosphate buffered saline | Wisent | 311-010-CL | 1x PBS |
| 21Gx 1 1/2 (0.8mmx40mm) PrecisionGlide Needle | BD | 305167 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Wisent | 311-511-CL | 1x HBSS |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A4503-50G | |
| Bovine serum | Sigma | B9433 | |
| 0.5M Ethylenediaminetetraacetic acid | BioShop | EDT111 | |
| Vacuum filter , 0.2 µm Filtropur V50 | Sarstedt | 83.1823.001 | |
| 28G 1/2 1 cc insulin syringe | BD | 329424 | |
| 60 mL syringe | BD | 309653 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Wisent | 319-005-CL | 1x DMEM with 4.5 g/L glucose and L-Glutamine and Sodium Pyruvate |
| Collagenase I | Sigma | C0130 | from Clostridium histolyticum |
| Hyaluronidase type I-S | Sigma | H3506 | |
| DNase-I | Sigma | D4513 | from bovine pancreas |
| Cell strainer, 40 µm Nylon | Falcon | 352340 | |
| Ammonium-Chloride- Potassium (ACK) lysis buffer | Lonza | 10-546E | |
| Alexa Fluor 700 anti-mouse/human CD11b | Biolegend | 101222 | 1:250 dilution |
| APC/Cy7 anti-mouse Ly-6c | Biolegend | 128025 | 1:250 dilution |
| APC anti-mouse CD103 | Biolegend | 121414 | 1:250 dilution |
| Brilliant Violet 605 anti-mouse CD11c | Biolegend | 117334 | 1:250 dilution |
| PE anti-mouse Ly-6G | Biolegend | 127607 | 1:250 dilution |
| Pacific Blue anti-mouse I-Ab | Biolegend | 116422 | 1:250 dilution |
| FITC anti-mouse CD64 (FcgRI) | Biolegend | 139315 | 1:250 dilution |
| PE/Cy7 anti-mouse CD45 | Biolegend | 103113 | 1:250 dilution |
| PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD45 | Biolegend | 103132 | 1:40 dilution |
| TruStain fcX (anti-mouse CD16/32) | Biolegend | 101320 | 1:100 dilution |
| True-Stain Monocyte Blocker | Biolegend | 426101 | 1:20 dilution |
| FlowJo V10 | TreeStar Inc | https://www.flowjo.com/solutions/flowjo | |
| Mouse: Batf3-/- | The Jackson Laboratory | JAX: 013755 |
References
- Marboe, C. C., Fenoglio, J. J. Pathology and natural history of human myocarditis. Pathology and Immunopathology Research. 7 (4), 226-239 (1988).
- Epelman, S., et al. Embryonic and adult-derived resident cardiac macrophages are maintained through distinct mechanisms at steady state and during inflammation. Immunity. 40 (1), 91-104 (2014).
- Pinto, A. R., et al. An abundant tissue macrophage population in the adult murine heart with a distinct alternatively-activated macrophage profile. PLoS One. 7 (5), 36814 (2012).
- Lavine, K. J., et al. Distinct macrophage lineages contribute to disparate patterns of cardiac recovery and remodeling in the neonatal and adult heart. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (45), 16029-16034 (2014).
- Fujiu, K., Wang, J., Nagai, R. Cardioprotective function of cardiac macrophages. Cardiovascular Research. 102 (2), 232-239 (2014).
- Hulsmans, M., et al. Macrophages Facilitate Electrical Conduction in the Heart. Cell. 169 (3), 510-522 (2017).
- Nahrendorf, M., et al. The healing myocardium sequentially mobilizes two monocyte subsets with divergent and complementary functions. Journal of Experimental Medicine. 204 (12), 3037-3047 (2007).
- Clemente-Casares, X., et al. A CD103(+) Conventional Dendritic Cell Surveillance System Prevents Development of Overt Heart Failure during Subclinical Viral Myocarditis. Immunity. 47 (5), 974-989 (2017).
- Van der Borght, K., et al. Myocardial Infarction Primes Autoreactive T Cells through Activation of Dendritic Cells. Cell Reports. 18 (12), 3005-3017 (2017).
- Galkina, E., et al. Preferential migration of effector CD8+ T cells into the interstitium of the normal lung. Journal of Clinical Investigation. 115 (12), 3473-3483 (2005).
- Edelson, B. T., et al. Peripheral CD103+ dendritic cells form a unified subset developmentally related to CD8alpha+ conventional dendritic cells. Journal of Experimental Medicine. 207 (4), 823-836 (2010).
