Isolamento e identificazione di cellule immunitarie extravascolare del cuore
Summary
Questo protocollo presenta un metodo semplice ed efficace per isolare, identificare e quantificare le cellule immuni che risiedono nel miocardio dei topi durante stato stazionario o l’infiammazione. Il protocollo combina digestione enzimatica e meccanica per la generazione di una sospensione di singola cellula che può essere ulteriormente analizzata tramite flusso cytometry.
Abstract
Il sistema immunitario è una componente essenziale di un cuore sano. Il miocardio è sede di una popolazione ricca dei sottoinsiemi delle cellule immuni differenti con compartimentazione funzionale sia durante stato stazionario diverse forme di infiammazione. Fino a poco tempo, lo studio delle cellule immunitarie nel cuore ha richiesto l’uso di microscopia o protocolli di digestione poco sviluppati, che fornito di sensibilità sufficiente durante l’infiammazione severa, ma erano tranquillamente in grado di identificano piccoli — ma chiave — popolazioni di cellule durante lo stato stazionario. Discutiamo qui, un metodo semplice combinazione enzimatica (collagenasi, ialuronidasi e DNasi) e digestione meccanica del cuore murino preceduta da somministrazione intravascolare di anticorpi fluorescente etichettati per differenziare piccolo ma inevitabile contaminanti intravascolare delle cellule. Questo metodo genera una sospensione di cellule vitali isolate che può essere analizzato tramite flusso cytometry per fenotipizzazione di identificazione e quantificazione, o ulteriormente purificate con fluorescenza-attivato delle cellule l’ordinamento o la separazione di biglie magnetiche per studi di analisi o in vitro trascrizionali. Includiamo un esempio di una dettagliata analisi citofluorimetrica per differenziare la chiave del macrofago e popolazioni di cellule dendritiche del cuore. Per un esperimento di dimensione medio (10 cuori) il completamento della procedura richiede 2 – 3 h.
Introduction
Diverse forme di stress del miocardio o danno, inclusi ischemico (ischemia riperfusione o infarto del miocardio) e non-ischemica (ipertensione o miocardite), promuovere il reclutamento di cellule infiammatorie con riparatore e protettivo, ma anche Proprietà patogene. Già nel 1891, Romberg descritto in primo luogo la presenza di infiltrati cellulari nel miocardio dei pazienti infettati con il tifo e la scarlattina1. Tuttavia, lo studio dettagliato delle cellule immuni cardiache richiesto lo sviluppo di tecniche più avanzate di immunofenotipizzazione. Di conseguenza, solo recentemente abbiamo iniziato a capire che una popolazione eterogenea di cellule del sistema immunitario con ruoli di manutenzione essenziali durante stato stazionario risiede all’interno del miocardio.
L’istologia è stato ed è tuttora, il metodo più comune per caratterizzare le cellule immuni cardiache durante l’infiammazione. Tuttavia, mentre l’istologia rappresenta un prezioso strumento diagnostico, suo utilizzo nello studio delle cellule immuni cardiache ha limitazioni importanti. Le cellule immunitarie che risiedono nel miocardio rappresentano una percentuale molto piccola delle cellule totali e sono più o meno uniformemente distribuite in uno spazio immenso proporzionalmente. Allo stesso modo, diverse forme di infiammazione cardiaca, quali miocardite virale, mostrano modelli focali di infiammazione. Questo significa che l’analisi accurata del sistema immunitario del cuore richiedono spesso più alti gradi di campionamento istologico, l’aumento del costo per ridurre i pregiudizi. Inoltre, l’istologia fornisce una quantità molto limitata di informazioni utilizzabili nell’identificazione delle cellule (ad es. numero di parametri). Con un numero sempre crescente di sottoinsiemi di cellule che richiedono l’utilizzo di più indicatori di espressione (compresi gli indicatori di superficie, fattori di trascrizione o molecole secrete), citometria a flusso si è affermata come il più potente strumento per immunophenotyping, a causa di alto-rendimento e basso costo.
L’uso di tecniche di immunophenotyping dipende strettamente lo sviluppo di protocolli di digestione efficiente che ha permesso per l’analisi di singole cellule di un gran numero di cellule. Lo sviluppo di protocolli esaustivi di estrazione delle cellule ha aperto una nuova finestra di opportunità nello studio della immunologia cardiaco. Attraverso la combinazione di digestione, citometria a flusso e trascrittomica, le principali popolazioni di macrofagi e cellule dendritiche che risiedono nel cuore sono stati caratterizzati2,3. La popolazione più abbondante di cellule immuni cardiache durante allo stato stazionario sono CD64++ MerTK macrofagi, che possono essere ulteriormente suddivisi sulla base di loro espressione di CCR2 o CD11c2. CCR2+ macrofagi hanno origine dal midollo osseo adulto ematopoiesi, considerando che la maggior parte di CCR2 macrofagi– , che possono esprimere livelli elevati o bassi di MHC-II, sono principalmente di origine prenatale. I macrofagi hanno funzioni chiave come riparazione4 e la rimozione di detriti5 durante la ferita o sostenere connettività elettrica6 in regime stazionario. Durante diverse forme di infiammazione si verificano un importante afflusso di Ly6CCiao MHC-IIlo CD64int monociti, che più successivamente differenziarsi in Ly6CCiao CCR2+ macrofagi2,7 . Una popolazione significativamente più piccola, ma importante, di cellule che risiedono nel miocardio di individui in buona salute è composto di cellule dendritiche8,9. I due sottoinsiemi principali di cardiaca convenzionale DCs (cDCs) sono stati recentemente caratterizzati: cDC1 (CD103+ DCs) e cDC2 (CD11b+ DCs). DCs svolgono un ruolo importante nella difesa contro l’infezione8 , ma può anche promuovere la auto-ferita durante l’infiammazione, in particolare durante l’infarto miocardico9.
Qui, descriviamo un metodo semplice per l’isolamento di cellule immuni cardiache vitali dal miocardio del mouse. Il metodo combina digestione enzimatica e meccanica con una filtrazione di cella-setaccio per ottenere una sospensione di singola cellula che può essere analizzata, o ulteriormente purificata, tramite flusso cytometry ordinamento o arricchimento di biglie magnetiche. Misurazioni accurate delle cellule del miocardio extravascular richiedono aspersione cardiaca al fine di rimuovere eventuali contaminanti dal flusso sanguigno del microvasculature cardiaco. Inoltre, vi presentiamo un passaggio facoltativo di etichettatura intravascolare delle cellule immuni che possono essere utilizzate per differenziare ulteriormente le cellule del miocardio da contaminanti intravascolare, basati sul Galkina et al protocollo10. Infine, presentiamo un’analisi di citometria a flusso di base per identificare le principali sottopopolazioni macrofago e cDC.
Protocol
Representative Results
Discussion
Infiammazione del miocardio, o miocardite, è una caratteristica delle malattie cardiovascolari più. Tuttavia, il miocardio non è privo di propri componenti immuni negli Stati di non-malattia. Durante stato stazionario, molte cellule immunitarie risiedono nel miocardio e svolgono un ruolo essenziale di manutenzione e protezione. La caratterizzazione di queste diverse popolazioni di cellule non sarebbe stato possibile senza i metodi come quello presentato in questo protocollo.
Una combinazion…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato dall’istituti canadesi di ricerca sanitaria (148808 e 148792), SE è stata sostenuta da un Heart and Stroke Foundation, premio personale dall’ufficio provinciale di Ontario, March of Dimes, Ted Rogers Centre per ricerca di cuore e Peter Munk Centro cardiaco. XCC detiene un Fellowship di Banting CIHR. LA tiene un cuore & Stroke/Richard Patricia Studentship Award.
Materials
| Phosphate buffered saline | Wisent | 311-010-CL | 1x PBS |
| 21Gx 1 1/2 (0.8mmx40mm) PrecisionGlide Needle | BD | 305167 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Wisent | 311-511-CL | 1x HBSS |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A4503-50G | |
| Bovine serum | Sigma | B9433 | |
| 0.5M Ethylenediaminetetraacetic acid | BioShop | EDT111 | |
| Vacuum filter , 0.2 µm Filtropur V50 | Sarstedt | 83.1823.001 | |
| 28G 1/2 1 cc insulin syringe | BD | 329424 | |
| 60 mL syringe | BD | 309653 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Wisent | 319-005-CL | 1x DMEM with 4.5 g/L glucose and L-Glutamine and Sodium Pyruvate |
| Collagenase I | Sigma | C0130 | from Clostridium histolyticum |
| Hyaluronidase type I-S | Sigma | H3506 | |
| DNase-I | Sigma | D4513 | from bovine pancreas |
| Cell strainer, 40 µm Nylon | Falcon | 352340 | |
| Ammonium-Chloride- Potassium (ACK) lysis buffer | Lonza | 10-546E | |
| Alexa Fluor 700 anti-mouse/human CD11b | Biolegend | 101222 | 1:250 dilution |
| APC/Cy7 anti-mouse Ly-6c | Biolegend | 128025 | 1:250 dilution |
| APC anti-mouse CD103 | Biolegend | 121414 | 1:250 dilution |
| Brilliant Violet 605 anti-mouse CD11c | Biolegend | 117334 | 1:250 dilution |
| PE anti-mouse Ly-6G | Biolegend | 127607 | 1:250 dilution |
| Pacific Blue anti-mouse I-Ab | Biolegend | 116422 | 1:250 dilution |
| FITC anti-mouse CD64 (FcgRI) | Biolegend | 139315 | 1:250 dilution |
| PE/Cy7 anti-mouse CD45 | Biolegend | 103113 | 1:250 dilution |
| PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD45 | Biolegend | 103132 | 1:40 dilution |
| TruStain fcX (anti-mouse CD16/32) | Biolegend | 101320 | 1:100 dilution |
| True-Stain Monocyte Blocker | Biolegend | 426101 | 1:20 dilution |
| FlowJo V10 | TreeStar Inc | https://www.flowjo.com/solutions/flowjo | |
| Mouse: Batf3-/- | The Jackson Laboratory | JAX: 013755 |
References
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