Orthotopic transplantatie van Syngeneic Long adenocarcinoom cellen te bestuderen van PD-L1 expressie
Summary
Hier beschrijven we een minimaal invasieve syngeneic orthotopic transplantatie model van muis Long adenocarcinoom cellen als een tijd – en kostenbesparende model om te studeren niet-kleincellige longkanker.
Abstract
Het gebruik van Muismodellen is onmisbaar voor het bestuderen van de pathofysiologie van verschillende ziekten. Met betrekking tot longkanker, verschillende modellen zijn beschikbaar, met inbegrip van genetisch gemanipuleerde modellen, alsmede modellen van de transplantatie. Echter zijn genetisch gemodificeerde Muismodellen tijdrovend en duur, terwijl sommige orthotopic transplantatie modellen moeilijk zijn te reproduceren. Hier is een niet-invasieve intratracheale leveringsmethode van longkanker tumorcellen als een alternatieve orthotopic transplantatie model beschreven. Het gebruik van muis Long adenocarcinoom cellen en syngeneic transplantaat ontvangers kunnen studeren tumorvorming onder de aanwezigheid van een volledig actief immuunsysteem. Bovendien, genetische manipulaties van tumor cellen voor transplantatie maakt dit model een aantrekkelijke tijdbesparende aanpak te bestuderen van de invloed van genetische factoren op de tumorgroei en tumor cel genexpressie profielen onder fysiologische omstandigheden. Met behulp van dit model, laten we zien dat Long adenocarcinoom cellen uitdrukkelijke verhoogde niveaus van de suppressor T-cel dood-ligand 1 (PD-L1) geprogrammeerd als volwassen in hun natuurlijke omgeving in vergelijking met de teelt in vitro.
Introduction
Longkanker is nog steeds veruit de grootste kanker-gerelateerde moordenaar in zowel mannen als vrouwen1. Sterker nog, volgens de American Cancer Society, jaarlijks meer mensen sterven aan longkanker dan van borst-, prostaat- en dikke darm kanker samen1. Tot voor kort, werden de meerderheid van de patiënten die lijden aan niet-kleincellige longkanker (NKCLK), die het meest voorkomende subtype van longkanker is, behandeld met platina gebaseerde chemotherapie in een eerstelijns-omgeving, meestal met de toevoeging van angiogenese remmers2. Alleen een subset van patiënten havens oncogene mutaties in de epidermale groeifactor receptor (EGFR), in anaplastic lymfoom kinase (ALK) of in ROS1, en kan worden behandeld met beschikbare targeting drugs3,4. Met de komst van immuun checkpoint-remmers ontstaan nieuwe hoop voor longkankerpatiënten, hoewel tot op heden slechts 20-40% van de patiënten reageren op immuun therapie5. Vandaar, verder onderzoek moet dit resultaat verbeteren door “fine-tuning”-immuun checkpoint therapie en combinatorische behandelingsopties onderzoeken.
Studeren longkanker, een breed scala van preklinische modellen zijn beschikbaar, met inbegrip van spontane modellen veroorzaakt door chemische stoffen en kankerverwekkende stoffen en genetisch gemanipuleerde muis modellen (GEMM) waar autochtone tumoren ontstaan naar aanleiding van de voorwaardelijke activering van oncogenen en/of de inactivering van tumor suppressor genen6,7,8. Deze modellen zijn van bijzondere waarde voor het onderzoeken van fundamentele processen in de ontwikkeling van de tumor van de longen, maar ze vereisen ook uitgebreide muizen fokken en experimenten zijn tijdrovend. Daarom profiteren veel studies die evaluatie van potentiële remmers van subcutane (patiënt-afgeleid) xenograft modellen waar menselijke long kanker cellijnen worden subcutaan ingespoten in immunodeficiëntie muizen9.
In deze modellen, is de micromilieu van tumoren niet vertegenwoordigd daarvan in kennis; Vandaar, onderzoekers ook gebruiken orthotopic transplantatie modellen, waar zijn tumorcellen intraveneus, intrabronchially, of direct geïnjecteerd in de Long parenchym10,11,12,13, 14,,15,16,17,18,19,20. Sommige van deze methoden zijn technisch uitdagende en moeilijk te worden gereproduceerd, en vereist intensieve training van de onderzoekers. 21 hier aangepast we een niet-invasieve orthotopic, intratracheale transplantatie methode in immunocompetent muizen, waar tumoren ontwikkelen binnen 3-5 weken en vertonen veel gelijkenissen met menselijke tumoren, voor het opwekken van de expressie van de T-cel suppressor geprogrammeerd dood-ligand 1 (PD-L1) op tumorcellen. 11 , 12 , 20 het gebruik van de muis tumorcellen afgeleid van GEMM modellen en syngeneic ontvangende muizen maakt goede studie van de communicatie van de tumor met inbegrip van immuuncellen. Bovendien kan gene bewerkingsgereedschappen zoals CRISPR/Cas9 technologie22 in vitro voor transplantatie die het onderzoek naar de invloed van genetische factoren in Long tumorvorming vergemakkelijkt worden gebruikt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Studeren Long fysiologische en pathologische gebeurtenissen in de Long, zijn invasieve en niet-invasieve intratracheale intubatie methoden voor de toediening van verschillende reagentia gebruikte26,27,28,29 ,30,31,32. Op het gebied van kanker, gebruiken onderzoekers de intratracheale (en in…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs bedank Safia Zahma voor haar hulp bij de voorbereiding van weefselsecties.
Materials
| mouse lung adenocarcinoma cell line | isolated in house | ||
| C57Bl/6 mice | F1 of the cross of the two backgrounds may be used (8-12 weeks) | ||
| 129S mice | |||
| RPMI 1640 Medium | Life Technologies | 11544446 | |
| Fetal Calf Serum | Life Technologies | 11573397 | |
| Penicillin/Streptomycin Solution | Life Technologies | 11548876 | |
| L-Glutamine | Life Technologies | 11539876 | |
| Trypsin, 0.25% (1X) with EDTA | Life Technologies | 11560626 | |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | 15575020 | |
| Ketasol (100 mg/ml Ketamine) | Ogris Pharma | 8-00173 | |
| Xylasol (20 mg/ml Xylazine) | Ogris Pharma | 8-00178 | |
| BD Insyste (22GA 1.00 IN) | BD | 381223 | |
| Blunt forceps | Roboz | RS8260 | |
| Leica CLS150 LED | Leica | 30250004 | Fibre Light Illuminator |
| Student Iris Scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| DNase I (RNase-Free) | New England Biolabs | M0303S | |
| Collagenase Type I | Life Technologies | 17100017 | |
| ACK Lysing Buffer | Lonza | 10-548E | |
| CD274 (PD-L1, B7-H1) Monoclonal Antibody (MIH5), PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-5982-82 | |
| Rat IgG2a kappa Isotype Control, PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-4321-82 |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2018. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (1), 7-30 (2018).
- Zappa, C., Mousa, S. A. Non-small cell lung cancer: current treatment and future advances. Translational Lung Cancer Research. 5 (3), 288-300 (2016).
- Dolly, S. O., Collins, D. C., Sundar, R., Popat, S., Yap, T. A. Advances in the Development of Molecularly Targeted Agents in Non-Small-Cell Lung. Drugs. 77 (8), 813-827 (2017).
- Stinchcombe, T. E. Targeted Therapies for Lung Cancer. Cancer Treatment Research. 170, 165-182 (2016).
- Brody, R., et al. PD-L1 expression in advanced NSCLC: Insights into risk stratification and treatment selection from a systematic literature review. Lung Cancer. 112, 200-215 (2017).
- Safari, R., Meuwissen, R. Practical use of advanced mouse models for lung cancer. Methods in Molecular Biology. 1267, 93-124 (2015).
- DuPage, M., Dooley, A. L., Jacks, T. Conditional mouse lung cancer models using adenoviral or lentiviral delivery of Cre recombinase. Nature Protocols. 4 (7), 1064-1072 (2009).
- Kwon, M. C., Berns, A. Mouse models for lung cancer. Molecular Oncology. 7 (2), 165-177 (2013).
- Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research. Cancer Discovery. 4 (9), 998-1013 (2014).
- Chen, X., et al. An orthotopic model of lung cancer to analyze primary and metastatic NSCLC growth in integrin alpha1-null mice. Clinical & Experiment Metastasis. 22 (2), 185-193 (2005).
- Kang, Y., et al. Development of an orthotopic transplantation model in nude mice that simulates the clinical features of human lung cancer. Cancer Science. 97 (10), 996-1001 (2006).
- Kang, Y., et al. Proliferation of human lung cancer in an orthotopic transplantation mouse model. Experimental and Therapeutic. 1 (3), 471-475 (2010).
- Kuo, T. H., et al. Orthotopic reconstitution of human small-cell lung carcinoma after intravenous transplantation in SCID mice. Anticancer Research. 12 (5), 1407-1410 (1992).
- Li, B., et al. A novel bioluminescence orthotopic mouse model for advanced lung cancer. Radiation Research. 176 (4), 486-493 (2011).
- Mase, K., et al. Intrabronchial orthotopic propagation of human lung adenocarcinoma–characterizations of tumorigenicity, invasion and metastasis. Lung Cancer. 36 (3), 271-276 (2002).
- McLemore, T. L., et al. Novel intrapulmonary model for orthotopic propagation of human lung cancers in athymic nude mice. Cancer Research. 47 (19), 5132-5140 (1987).
- Tsai, L. H., et al. The MZF1/c-MYC axis mediates lung adenocarcinoma progression caused by wild-type lkb1 loss. Oncogene. 34 (13), 1641-1649 (2015).
- Winslow, M. M., et al. Suppression of lung adenocarcinoma progression by Nkx2-1. Nature. 473 (7345), 101-104 (2011).
- Zou, Y., Fu, H., Ghosh, S., Farquhar, D., Klostergaard, J. Antitumor activity of hydrophilic Paclitaxel copolymer prodrug using locoregional delivery in human orthotopic non-small cell lung cancer xenograft models. Clinical Cancer Research. 10 (21), 7382-7391 (2004).
- Buckle, T., van Leeuwen, F. W. Validation of intratracheal instillation of lung tumour cells in mice using single photon emission computed tomography/computed tomography imaging. Lab Animal. 44 (1), 40-45 (2010).
- Berry-Pusey, B. N., et al. A semi-automated vascular access system for preclinical models. Physics in Medicine & Biology. 58 (16), 5351-5362 (2013).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Singer, B. D., et al. Flow-cytometric method for simultaneous analysis of mouse lung epithelial, endothelial, and hematopoietic lineage cells. American Journal of Physiology – Lung Cellular and Molecular Physiology. 310 (9), L796-L801 (2016).
- Moll, H. P., et al. Afatinib restrains K-RAS-driven lung tumorigenesis. Science Translational Medicine. 10 (446), (2018).
- Campeau, E., et al. A versatile viral system for expression and depletion of proteins in mammalian cells. PLoS One. 4 (8), e6529 (2009).
- Gui, L., Qian, H., Rocco, K. A., Grecu, L., Niklason, L. E. Efficient intratracheal delivery of airway epithelial cells in mice and pigs. American Journal of Physiology – Lung Cellular and Molecular Physiology. 308 (2), L221-L228 (2015).
- Helms, M. N., Torres-Gonzalez, E., Goodson, P., Rojas, M. Direct tracheal instillation of solutes into mouse lung. Journal of Visualized Experiments. (42), e1941 (2010).
- Lin, Y. W., et al. Pharmacokinetics/Pharmacodynamics of Pulmonary Delivery of Colistin against Pseudomonas aeruginosa in a Mouse Lung Infection Model. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 61 (3), (2017).
- Wegesser, T. C., Last, J. A. Lung response to coarse PM: bioassay in mice. Toxicology and Applied Pharmacology. 230 (2), 159-166 (2008).
- Cai, Y., Kimura, S. Noninvasive intratracheal intubation to study the pathology and physiology of mouse lung. Journal of Visualized Experiments. (81), e50601 (2013).
- Lawrenz, M. B., Fodah, R. A., Gutierrez, M. G., Warawa, J. Intubation-mediated intratracheal (IMIT) instillation: a noninvasive, lung-specific delivery system. Journal of Visualized Experiments. (93), e52261 (2014).
- Vandivort, T. C., An, D., Parks, W. C. An Improved Method for Rapid Intubation of the Trachea in Mice. Journal of Visualized Experiments. (108), e53771 (2016).
