أورثوتوبيك زرع الخلايا غدية الرئة سينجينيك لدراسة التعبير PD-L1
Summary
هنا يصف لنا نموذج أورثوتوبيك سينجينيك مينيملي زرع خلايا غدية الرئة الماوس كنموذج تخفيض وقت وتكلفة لدراسة الخلية غير الصغيرة سرطان الرئة.
Abstract
استخدام نماذج الماوس لا غنى عنه لدراسة الفسيولوجيا المرضية للأمراض المختلفة. فيما يتعلق بسرطان الرئة، والعديد من النماذج المتاحة، وراثيا بما في ذلك تصميم النماذج، فضلا عن نماذج الزرع. نماذج الماوس المهندسة وراثيا غير مضيعة للوقت وباهظة التكاليف، بينما بعض نماذج زرع أورثوتوبيك يصعب إعادة إنتاجها. هنا، يوصف بأسلوب توصيل تحسن غير الغازية للرئة ورم الخلايا كنموذج لزرع أورثوتوبيك بديلة. يسمح استخدام الماوس الرئة خلايا غدية والمتلقين الاختلاس سينجينيك دراسة tumorigenesis تحت وجود نظام المناعة نشط بشكل كامل. وعلاوة على ذلك، التلاعبات الجينية لورم الخلايا قبل الزرع يجعل ملامح هذا النموذج نهج توفير الوقت جذابة لدراسة أثر العوامل الوراثية على نمو الورم والتعبير الجيني في خلايا الورم تحت الظروف الفسيولوجية. باستخدام هذا النموذج، نعرض هذه الرئة خلايا غدية المبرمجة صريح زيادة مستويات القامع تي خلية الموت-يجند 1 (PD-L1) عندما نمت في بيئتها الطبيعية بالمقارنة مع زراعة في المختبر.
Introduction
سرطان الرئة هو لا تزال حتى الآن أكبر قاتل المتصلة بالسرطان في كل من الرجال والنساء1. وفي الواقع، وفقا “جمعية السرطان الأمريكية”، كل سنة أكثر الناس يموتون بسبب سرطان الرئة من الثدي والبروستاتا، والقولون السرطان معا1. وحتى وقت قريب، أغلبية المرضى الذين يعانون من سرطان الرئة الخلية غير الصغيرة (NSCLC)، وهو النوع الأكثر وفرة من سرطان الرئة، تعامل مع العلاج الكيميائي على أساس البلاتين في السطر الأول، معظمها بالإضافة إلى الأوعية مثبطات2. مجموعة فرعية فقط من المرضى المرافئ النمطان الطفرات في مستقبلات عامل نمو البشرة (EGFR)، في الأورام اللمفاوية المتحولة كيناز (ALK)، أو في ROS1، ويمكن التعامل مع3،المخدرات تستهدف المتاحة4. مع ظهور مثبطات الحاجز المناعي، نشأ أمل جديد لمرضى سرطان الرئة، على الرغم من أن حتى الآن، سوى 20 – 40% مرضى تستجيب للعلاج المناعي5. ومن ثم يلزم البحث كذلك تحسين هذه النتيجة بالضبط الدقيق للعلاج المناعي نقطة تفتيش وتحقق من خيارات العلاج كومبيناتوري.
دراسة سرطان الرئة، مجموعة واسعة من النماذج السريرية المتاحة، بما في ذلك نماذج عفوية الناجمة عن المواد الكيميائية والمواد المسببة للسرطان والماوس المهندسة وراثيا نماذج (جيم) حيث تنشأ الأورام أصلي عقب تفعيل الشرطي المسرطنة و/أو المنظمة من ورم المكثف الجينات6،،من78. هذه النماذج ذات قيمة خاصة للتحقيق في العمليات الأساسية في التنمية ورم في الرئة، ولكن يحتاجون أيضا إلى الفئران واسعة تربية، والتجارب مضيعة للوقت. ولذلك، العديد من دراسات تقييم احتمال مثبطات الاستفادة من نماذج إكسينوجرافت تحت الجلد (المستمدة من المريض) حيث يتم حقن خطوط خلايا سرطان الرئة البشرية تحت الجلد في الفئران العوز9.
في هذه النماذج، لم يتم تمثيل ميكروميليو الأورام تبعاً لذلك؛ ومن ثم، الباحثون أيضا استخدام نماذج زرع أورثوتوبيك، حيث يتم حقن الخلايا السرطانية عن طريق الوريد، إينترابرونتشيالي، أو مباشرة في الرئة حمة10،11،،من1213، 14،15،16،،من1718،،من1920. بعض هذه الطرق صعبة من الناحية الفنية، من الصعب على استنساخ، وتتطلب تدريبا مكثفا للباحثين. 21 هنا يمكننا تكييفه أورثوتوبيك غير الغازية، تحسن أسلوب زرع في الفئران الأشخاص، حيث وضع في غضون 3-5 أسابيع الأورام ويحمل التشابه الكبير للأورام البشرية، للحث على التعبير عن تي-الخلية القامع المبرمجة الموت-يجند 1 (PD-L1) في الخلايا السرطانية. 11 , 12 , 20 استخدام الماوس ورم الخلايا المستمدة من نماذج جيمم والفئران المستفيدة سينجينيك يتيح دراسة سليمة لورم المكروية بما في ذلك الخلايا المناعية. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام الجينات أدوات التحرير مثل كريسبر/Cas9 التكنولوجيا22 في المختبر قبل الزرع الذي يسهل التحقيق في تأثير العوامل الوراثية في الرئة توموريجينيسيس.
Protocol
Representative Results
Discussion
دراسة الأحداث الرئة الفسيولوجية ومرضية في الرئة وهي أساليب تنبيب إعطاء الغازية وغير الغازية لتقطير الكواشف المختلفة المستخدمة على نطاق واسع26،،من2728،29 ،30،،من3132</su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
المؤلف يود أن يشكر زاما صفية لمساعدتها بإعداد أقسام الأنسجة.
Materials
| mouse lung adenocarcinoma cell line | isolated in house | ||
| C57Bl/6 mice | F1 of the cross of the two backgrounds may be used (8-12 weeks) | ||
| 129S mice | |||
| RPMI 1640 Medium | Life Technologies | 11544446 | |
| Fetal Calf Serum | Life Technologies | 11573397 | |
| Penicillin/Streptomycin Solution | Life Technologies | 11548876 | |
| L-Glutamine | Life Technologies | 11539876 | |
| Trypsin, 0.25% (1X) with EDTA | Life Technologies | 11560626 | |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | 15575020 | |
| Ketasol (100 mg/ml Ketamine) | Ogris Pharma | 8-00173 | |
| Xylasol (20 mg/ml Xylazine) | Ogris Pharma | 8-00178 | |
| BD Insyste (22GA 1.00 IN) | BD | 381223 | |
| Blunt forceps | Roboz | RS8260 | |
| Leica CLS150 LED | Leica | 30250004 | Fibre Light Illuminator |
| Student Iris Scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| DNase I (RNase-Free) | New England Biolabs | M0303S | |
| Collagenase Type I | Life Technologies | 17100017 | |
| ACK Lysing Buffer | Lonza | 10-548E | |
| CD274 (PD-L1, B7-H1) Monoclonal Antibody (MIH5), PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-5982-82 | |
| Rat IgG2a kappa Isotype Control, PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-4321-82 |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2018. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (1), 7-30 (2018).
- Zappa, C., Mousa, S. A. Non-small cell lung cancer: current treatment and future advances. Translational Lung Cancer Research. 5 (3), 288-300 (2016).
- Dolly, S. O., Collins, D. C., Sundar, R., Popat, S., Yap, T. A. Advances in the Development of Molecularly Targeted Agents in Non-Small-Cell Lung. Drugs. 77 (8), 813-827 (2017).
- Stinchcombe, T. E. Targeted Therapies for Lung Cancer. Cancer Treatment Research. 170, 165-182 (2016).
- Brody, R., et al. PD-L1 expression in advanced NSCLC: Insights into risk stratification and treatment selection from a systematic literature review. Lung Cancer. 112, 200-215 (2017).
- Safari, R., Meuwissen, R. Practical use of advanced mouse models for lung cancer. Methods in Molecular Biology. 1267, 93-124 (2015).
- DuPage, M., Dooley, A. L., Jacks, T. Conditional mouse lung cancer models using adenoviral or lentiviral delivery of Cre recombinase. Nature Protocols. 4 (7), 1064-1072 (2009).
- Kwon, M. C., Berns, A. Mouse models for lung cancer. Molecular Oncology. 7 (2), 165-177 (2013).
- Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research. Cancer Discovery. 4 (9), 998-1013 (2014).
- Chen, X., et al. An orthotopic model of lung cancer to analyze primary and metastatic NSCLC growth in integrin alpha1-null mice. Clinical & Experiment Metastasis. 22 (2), 185-193 (2005).
- Kang, Y., et al. Development of an orthotopic transplantation model in nude mice that simulates the clinical features of human lung cancer. Cancer Science. 97 (10), 996-1001 (2006).
- Kang, Y., et al. Proliferation of human lung cancer in an orthotopic transplantation mouse model. Experimental and Therapeutic. 1 (3), 471-475 (2010).
- Kuo, T. H., et al. Orthotopic reconstitution of human small-cell lung carcinoma after intravenous transplantation in SCID mice. Anticancer Research. 12 (5), 1407-1410 (1992).
- Li, B., et al. A novel bioluminescence orthotopic mouse model for advanced lung cancer. Radiation Research. 176 (4), 486-493 (2011).
- Mase, K., et al. Intrabronchial orthotopic propagation of human lung adenocarcinoma–characterizations of tumorigenicity, invasion and metastasis. Lung Cancer. 36 (3), 271-276 (2002).
- McLemore, T. L., et al. Novel intrapulmonary model for orthotopic propagation of human lung cancers in athymic nude mice. Cancer Research. 47 (19), 5132-5140 (1987).
- Tsai, L. H., et al. The MZF1/c-MYC axis mediates lung adenocarcinoma progression caused by wild-type lkb1 loss. Oncogene. 34 (13), 1641-1649 (2015).
- Winslow, M. M., et al. Suppression of lung adenocarcinoma progression by Nkx2-1. Nature. 473 (7345), 101-104 (2011).
- Zou, Y., Fu, H., Ghosh, S., Farquhar, D., Klostergaard, J. Antitumor activity of hydrophilic Paclitaxel copolymer prodrug using locoregional delivery in human orthotopic non-small cell lung cancer xenograft models. Clinical Cancer Research. 10 (21), 7382-7391 (2004).
- Buckle, T., van Leeuwen, F. W. Validation of intratracheal instillation of lung tumour cells in mice using single photon emission computed tomography/computed tomography imaging. Lab Animal. 44 (1), 40-45 (2010).
- Berry-Pusey, B. N., et al. A semi-automated vascular access system for preclinical models. Physics in Medicine & Biology. 58 (16), 5351-5362 (2013).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Singer, B. D., et al. Flow-cytometric method for simultaneous analysis of mouse lung epithelial, endothelial, and hematopoietic lineage cells. American Journal of Physiology – Lung Cellular and Molecular Physiology. 310 (9), L796-L801 (2016).
- Moll, H. P., et al. Afatinib restrains K-RAS-driven lung tumorigenesis. Science Translational Medicine. 10 (446), (2018).
- Campeau, E., et al. A versatile viral system for expression and depletion of proteins in mammalian cells. PLoS One. 4 (8), e6529 (2009).
- Gui, L., Qian, H., Rocco, K. A., Grecu, L., Niklason, L. E. Efficient intratracheal delivery of airway epithelial cells in mice and pigs. American Journal of Physiology – Lung Cellular and Molecular Physiology. 308 (2), L221-L228 (2015).
- Helms, M. N., Torres-Gonzalez, E., Goodson, P., Rojas, M. Direct tracheal instillation of solutes into mouse lung. Journal of Visualized Experiments. (42), e1941 (2010).
- Lin, Y. W., et al. Pharmacokinetics/Pharmacodynamics of Pulmonary Delivery of Colistin against Pseudomonas aeruginosa in a Mouse Lung Infection Model. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 61 (3), (2017).
- Wegesser, T. C., Last, J. A. Lung response to coarse PM: bioassay in mice. Toxicology and Applied Pharmacology. 230 (2), 159-166 (2008).
- Cai, Y., Kimura, S. Noninvasive intratracheal intubation to study the pathology and physiology of mouse lung. Journal of Visualized Experiments. (81), e50601 (2013).
- Lawrenz, M. B., Fodah, R. A., Gutierrez, M. G., Warawa, J. Intubation-mediated intratracheal (IMIT) instillation: a noninvasive, lung-specific delivery system. Journal of Visualized Experiments. (93), e52261 (2014).
- Vandivort, T. C., An, D., Parks, W. C. An Improved Method for Rapid Intubation of the Trachea in Mice. Journal of Visualized Experiments. (108), e53771 (2016).
