フローサイトメトリーによる解析は、純粋培養の調査および微生物群集の動態を監視するための貴重な証明されています。それぞれサンプリング データの分析、純粋培養と挑戦の行列のように明確な媒体同様に複雑なコミュニティからの 3 つの包括的なワークフローを提案します。
純粋培養の調査と微生物群集の動態のモニタリングは、理解し、自然の生態系と微生物によって駆動される技術的なアプリケーションを制御することが重要です。次世代配列方法は広く、内細菌叢解析を解決する利用が、彼らは、一般的にリソースと時間がかかるほとんど質的情報を提供します。フローサイト マイクロバイそれらの欠点に苦しまないし、相対サブコミュニティ微量含有量と絶対に提供することができます携帯番号ラインで。それは直接の系統情報を提供しないが、分析深さとアプローチをシーケンスの解像度が向上します。医療研究のルーチンの設定とは対照的に、フローサイトメトリーはまだ広くマイクロバイ分析に使用されます。サンプル準備およびデータ解析パイプラインの不足している情報は、よく教科書の流れ cytometry アプリケーションになるマイクロバイ分析課題に直面して研究者の参入障壁を作成できます。ここでは、純粋培養のための 3 つの包括的なワークフローを提案する、複雑なコミュニティがそれぞれ挑戦的な行列の中で複雑なコミュニティをクリアします。我々 は個々 のサンプリングと固定の手順を記述する、それぞれのサンプルのセットのプロトコルを汚すを最適化します。手の込んだ複雑な研究の中心とフローサイトメトリー解析とアプリケーション集中ベンチ トップ デバイス、プロシージャを並べ替えセルを記述する、データ分析パッケージを提案します。さらに重要な実験的コントロールを提案し、, それぞれのサンプル セットに提示されたワークフローを適用します。
微生物は、生きている人間の多くの面で重要な役割を果たします。彼らは惑星の炭素、窒素、リン、硫黄サイクル12,3を分解と同様、廃水処理などの様々 な産業で4生体触媒の合成として法の主要な生物的ドライバー5やバイオ6。彼らは人間の健康および代謝7、8に直接的な影響は人間のマイクロバイを構成します。したがって、構造、関数および即時の環境への応答における微生物の挙動については、完全に理解し、これらのシステムを操作を目指すなら必要です。次世代シークエンシング (NGS) はマイクロバイ構造と機能9を解決する技術の確立です。ただし、解析と NGS データの評価定量的な情報を得られることはできません、まだ高価、時間のかかる、廊下のパフォーマンスでは敷地内の結果を提供すること準備ができているです。いくつかの細菌は、1 h と常に一定の環境の10のコミュニティ構造の変化の原因の下の生成時刻を表示します。次のようなダイナミクス シーケンスのアプローチを使用して最も科学的研究所の金融・労働力容量をオーバーしました。
対照的に、フローサイトメトリーは、時間、労働とコスト効率を維持しながら NGS データと同様にコミュニティ指紋を提供できます。流れフローサイトメトリー技術単一セルのレベルの微生物群集動態線に従うことを紹介します。異なり、NGS、フローサイトメトリーは機能遺伝子系統所属や情報を提供していません、定量的細胞数を提供します。フローサイトメトリーを用いた微生物群集が明瞭な光散乱と蛍光特性 ((FSC) 前方散乱、側方散乱 (SSC) がわかるようにセル サイズと細かさでそれぞれ) サブコミュニティに解決できます。提示方法を主に利用してセル サイズ- および DNA 量の特定の細胞の種類と生理 (成長) の状態に関連付けられている関連する情報。DNA 量は、UV-興奮 4′, 6-diamidino 2′-phenylindole (DAPI) DNA の AT リッチ領域にバインドし、異なる染色体レベルを解決することができますも染料を使用して定量化されます。DAPI の蛍光と FSC を組み合わせることによって 50 以上のサブコミュニティ区別および監視が可能時間11とともに組成を変えることを。サブコミュニティの豊富なバリエーションが pH と製品価12, グローバル パラメーター、天気13,14などまたは腸や唾液の場合など、マイクロ環境の環境の変化を関連付けることができます。特定の治療15内細菌叢解析。これらの相関関係には、キーのサブコミュニティがコミュニティ全体の代謝ネットワークの特定の機能を担当が明らかにします。キーのサブコミュニティが具体的に昇格または周囲の微小環境を変えることによって抑制したり後続のシーケンス15やプロテオームの調査のための16のためにソートします。
ただし、微生物群集フローサイトメトリー確立されていませんまだ広く流量フローサイトメトリー装置微生物集団あるいはコミュニティを正しく解決することができる数がかなり低いため。さらに、効果的なデータ評価、コミュニティ解析パイプラインの経験の欠如は、マイクロバイ分析課題に直面して研究者の参入の障壁を提起するかもしれない。これらの問題に取り組むために包括的なワークフローを設けています。一般的な適用性を示すためには、それを 3 模範的なサンプル セット (補足ファイル 1 S1)、すなわち私に示します) バイオ テクノロジー用に定義された明確な媒体 (シュードモナスの putida KT 2440 上で成長して純粋培養 (PC)ブドウ糖)、ii) 明確な媒体 (合成廃水の活性汚泥コミュニティ (ASC)) と iii で複雑な実験コミュニティ) 密な行列 (トウモロコシのサイレージのコミュニティ (BC) バイオガス) の自然環境から複雑なコミュニティ。
それぞれのサンプル セットのプロトコルの選択に影響を与えるいくつかの要因。深い凍結は有毒な化学薬品の使用を好まれる場合がほとんどショック フロスティングのため液体窒素の使用のためのラボ環境に限定。ホルムアルデヒドの安定化とその後エタノール固定により、分注の準備を必要とせず一括サンプリングと長期間にわたって安定する証明されています。タンパク質フロック、ホルムアルデヒド、次は好ましくない信号雑音比を引き起こす可能性がありますので、人間の唾液15などのタンパク質が豊富なサンプルは、問題となるかもしれません。サンプルの乾燥、この比較での手順のほとんどの時間 (合計で約 1 時間) がかかりますが、有毒化学物質なしサイトで実行することができます。それは、チューブ、冷却またはその他の危険注意せず簡単に出荷することで安定したペレットを得られます。さらに、提案された11をされているたくさんの代替の固定方法。新しいサンプル セットを導入するとき、異なるプロトコルの解像度と固定の安定性をテストするを強くお勧めします。
セットを分析する 2 つの異なる流れの cytometers を使いました: セルソーターと現場適用5に適して表示されます ii) アプリケーション ベンチのトップ アナライザー i) 洗練された高価な研究が中心します。BC は、PC や ASC はセルソーターで測定されたベンチ トップ アナライザーで測定しました。3 つの模範的なサンプルの分析は、最適化された再現性、サンプルの安定性とワークフローの利便のため必要な異なったプロシージャを設定します。次のプロトコルは 3 つの異なるシステムのセクションを指定します。
微生物の個体群と群集の解析に成功には、適切にチューニングされた cytometers、セルのパラメーターの適切な選択、サンプリング、測定、データの評価に向けた固定から信頼性の高いワークフローが必要です。選択したセルのパラメーターする必要があります利用可能な励起波長のコンソート。使用し、低濃度に非常に敏感である DAPI をお勧めしますしかし標準の cytometer セットアップで通常構成されていない紫外線レーザーによって励起する必要があります。他の染料は、サイバーなど緑の私、また、汚れ全体集団やコミュニティが一般的に劣っている解決策を提供します。微生物群集の魚プロシージャまたは生存率テストを使用してはお勧めしません。これらのアプローチは、定量化、およびコミュニティの個々 の種への影響は不明であるために、制御を確認することが可能ではありません。彼らに確実にテスト不能、典型的なコミュニティの相当な割合はまだ純粋な文化として利用できない限り。
セルの並べ替えと同様、サンプリングと固定の手順、プロトコルで重要な手順が含まれます。サンプリングすることができます特定の純粋培養とフロックに集計またはサンプル マトリックスの粒子に付着する微生物群集の傾向によって複雑になります。これらの凝集体を放散し、フローサイトメトリーによる解析結果の信頼性を保証するためにそれらを導入する前に、サンプル内のセルを区切るが欠かせません。発表準備のプロトコルが単一細胞解析を可能にする最適化されました。最終 50 μ m のろ過は、残留集計セルソーターの 70 μ m ノズルとアナライザーの流れキュベットの目詰まりを防止し測定の前に実行されます。廃水処理プラントからセル フロックは、特に豊富な堅牢であり、システムの機能に不可欠です。汚泥ベース確立されたプロトコルをテストする本格的な排水処理プラントの別のタンクで微生物と、浮遊性を調査しました。集計した消費明らかに細胞集塊形成汚泥と群集組成は安定していた。さらに、浮遊性と汚泥ベースのコミュニティはすべての 3 つのサンプル タンク (図 8、補助ファイル 1-S10) でそれらの間の顕著な類似性を展示しました。これらの結果はホルムアルデヒド、エタノール執着の新鮮な -、ホルムアルデヒド処理 – 比較 16S rDNA 増幅配列による検証した-、および並べ替えられたサンプル10。それにもかかわらず、非常に強力なバイオ フィルム細菌密接に接続されたチェーンの成長などの環境試料に挑戦できない可能性が放散します。土壌サンプルは、ユビキタスの粒子、ヒストグラムに表示によって豊富なセルが見えなくなるとは特に問題があります。このような場合、伝統的な配列方法は適用する必要があります。
すべての新しいサンプル セットの固定の安定性は、結果の妥当性を保証するための実験を設計する前にテスト必要があります。良い固定の安定性には、プールされた染色と 1 日に複数のサンプルの時間ポイントの測定もできます。さらに、レプリケーションの測定と回顧セルソート決定的なタイム ポイントのまとめと実験の最終的な評価の後をできます。純粋培養の固定の安定性は 28 日間で (図 9) を確認しました。敷地内の実験サンプル輸送を含む、固定安定性は (この例では、活性汚泥のコミュニティのため 60 日、バイオガスのコミュニティの補足ファイル 1 S9 の 195 日) で長い期間にわたってテストしてください。
染色は通常問題ではありませんが、バイオ情報評価ツールのアプリケーションを許可する生物学的標準で制御する必要があります。大腸菌BL21 のモックのひずみを使いました (DE3) ASC プロトコルによると執着は、すべて染色バッチで使用するための備蓄します。
DAPI、SYBR グリーンから離れて私がされて正常に適用数年14,23,24,25,26の微生物コミュニティを解決します。SYBR グリーン高および低核酸サブセット (HNA および LNA) にコミュニティを解決することができますオンラインのやり方で生きている細胞を用いたします。DAPI、DNA への結合の詳細し 1 つのサンプル セットに 50 以上のサブコミュニティの区別をできるようにしかし、染色する前に固定の手順が必要です。
セルの並べ替えこのアプローチの顕著な特徴は、特定のサブコミュニティがさらに関心のある場合に適用できます。それも PFA (30 分だけ実行されます) もエタノール処理または10を汚す DAPI が後続 16S 私アンプリコン シーケンスにマイナスの影響を持っていたことを強調する必要があります。固定の潜在的な影響し、ステイニングがサブコミュニティ メタゲノム解析はまだテストする必要があります。
多くのコミュニティ機能とトレンドのダイナミクスに関する情報ことができる並べ替え方法から独立したバイオインフォマティクスのツールは、仮想細胞による細胞レベルのコミュニティ機能を解決および非生物的でこれらの機能を接続を含む場合パラメーター。
最近、新しいバイオインフォマティクス評価ツール、両方のサイバーのためすべての有用な数は私と DAPI アプローチ グリーン、フローサイトメトリーによるコミュニティがパターンを解決するために開発されました。これらの FlowFP27、(flowCHIC20、flowCyBar28), 本研究では、パッケージを使用して新鮮な水社会29設立デコンボリューション モデルとによると自分の生理系統を区別するためのツール特徴30。また、フローサイトメトリーによる多様性が断固とした25をすることができます、オンライン ツール10微生物群集のも安定性が続く今ことができます。
したがって、フローサイトメトリー解析における微生物群集と非生物的パラメーター相関の迅速な評価になったら大きな利点があります。しかし、まだメソッドには制限があります。それは、経験に基づいてゲート設定プロシージャのための flowCyBar ツールを使ってオンライン本当に適用できません。さらに、カスタムメイドで使いやすい流れの cytometers の開発は流れフローサイトメトリー マイクロバイ分析アプローチによる増殖を大きく前進するでしょう。この方向の最初のステップは引き受けられた28です。
それにより細菌の世代時間の範囲内で高周波の監視と生態学的パラダイムがフローサイト メーター データ5 に適用されることが示されている、微生物生態学、微生物フローサイトメトリーの応用を想定することができます。 ,10。メソッドはスイス連邦共和国の31の必須飲料水コントロールのような自然環境の定期上映のため非常に便利です。それは人間15または動物32マイクロバイ スクリーニングのような医療用の貴重なツールにすることができます。さらに、バイオインフォマティクスの最新動向が微生物の管理下システムのプロセス コントロールに不可欠なセンサーをする微生物フローサイトメトリーを有効にします。微生物群集フローサイトメトリーは、高解像度の特定のコミュニティのサブセットのゲノムの調査を可能にする細胞の選別のスクリーニング ツールを提供します。
The authors have nothing to disclose.
我々 は感謝してプロシージャと純粋培養と活性汚泥コミュニティのデータセットをそれぞれ提供するマイケル ・ ヤーンと Yuting 郭を認めます。我々 はさらに、バイオガスのコミュニティ サンプルの解析にカトリン ・ Mörters を感謝します。この作業によって賄われていた (FNR、プロジェクト バイオガス指紋 Nr。 22008313) Fachagentur Nachwachsende Rohstoffe バテレ ドイツの中央政府大臣に代わって食料・農業 (BMEL)、中央技術革新プログラム連邦省の中小企業 (ジンバブエ)経済情勢とエネルギー (BMWi) (INAR 夕べ、16KN043222)、ドイツ Bundesstiftung 環 (DBU、プロジェクト オンデマンドからだ・ フォン ・ Phosphatdünger オーストラリア Reststoffen フォン ブラウエライ und Kläranlage 33960/01-32)、教育のためドイツの中央政府大臣のと研究 (BMBF) (FZK 03XP0041G) とヘルムホルツ協会の資金プログラム指向 (POF III R31 トピック 3 バイオ エネルギー)。
Milli-Q system Synthesis A10 | Merck, Darmstadt, (GER) | ||
BioPak Ultrafiltration Cartridge | Merck, Darmstadt, (GER) | CDUF BI0 01 | |
MoFlo Legacy cell sorter | Beckman-Coulter, Brea, California (USA) | ||
Innova 90C | Coherent, Inc , Santa Clara (USA) | 334 nm – 364 nm, 100 mW | |
Innova 70C | Coherent, Inc , Santa Clara (USA) | 488 nm, 400 mW | |
Genesis MX488-500 STM OPS | Coherent, Inc , Santa Clara (USA) | 488 nm, 400 mW | |
Xcyte CY-355-150 | Lumentum, Milpitas, California, USA | 355 nm, 150 mW | |
Photomultiplier tubes R928 and R3896 | Hamamatsu Photonics, Hamamatsu City (Japan) | ||
Summit 4.3 software | Beckman-Coulter, Brea, California (USA) | ||
1 µm FluoSpheres | Molecular Probes, Eugene, Oregon (USA) | F8815 | 350/440 blue fluorescent |
2 μm YG FluoSpheres | Molecular Probes, Eugene, Oregon (USA) | F-8827 | 505/515 yellow-green fluorescent beads |
0.5 μm Fluoresbrite BB Carboxylate microspheres | PolyScience, Niles, Illinois (USA) | 18339 | 360/407 |
1 μm Fluoresbrite BB Carboxylate microspheres | PolyScience, Niles, Illinois (USA) | 17458 | 360/407 blue fluorescent |
1 µmYG FluoSpheres | Molecular Probes, Eugene, Oregon (USA) | F-13081 | 505/515 yellow-green fluorescent beads |
KH2PO4 | Sigma-Aldrich, St. Louis (USA) | CAS no. 7778-77-0 | |
KCl | Sigma-Aldrich, St. Louis (USA) | CAS no. 7447-40-7 | |
Cyflow Space | Sysmex Corporation, Kobe (Japan) | ||
UV Laser Genesis CX, | Coherent, Inc , Santa Clara (USA) | 355 nm, 150 mW | |
H6779-32 series PMTs | Hamamatsu Photonics, Hamamatsu City (Japan) | ||
FloMax software | Sysmex Partec GmbH, Görlitz, (GER) | ||
all optical filters | Carl Zeiss, Jena (GER) | ||
KH2PO4 | Sigma-Aldrich, St. Louis (USA) | CAS no. 7778-77-0 | |
KCl | Carl Roth, Karlsruhe (GER) | 6781.3 | |
FlowJo 10.0.8r1 | FlowJo, LLC, Ashland, Oregon (USA) | Build number: 42398 | |
R-software v.3.4.3 | R Core Team | ||
flowCHIC | http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/flowCHIC.html | ||
flowCyBar | http://www.bioconductor.org/packages/devel/bioc/html/flowCyBar.html |