流细胞分析已证明对研究纯文化和监测微生物群落动力学有价值。我们提供了三个全面的工作流程, 从抽样到数据分析, 到纯文化和复杂社区, 在清晰的介质中, 以及在挑战性的矩阵, 分别。
对纯文化的调查和微生物群落动态监测对于了解和控制微生物驱动的自然生态系统和技术应用至关重要。下一代测序方法被广泛地用于解决微生物, 但它们通常是资源和时间密集型的, 提供的主要是质量信息。流细胞菌群分析不受这些缺点的影响, 可以提供相对子社区丰度和绝对细胞数的在线。虽然它不提供直接的系统系统的信息, 它可以提高分析的深度和解决的排序方法。流式细胞术在研究和常规设置中与医学应用形成鲜明对比, 目前仍未广泛应用于微生物菌群分析。缺少样本准备和数据分析管道的信息可能会为面临微生物分析挑战的研究人员带来进入障碍, 这通常是教科书流式细胞术的应用。在这里, 我们分别为纯文化、复杂社区在具有挑战性的矩阵中的清晰介质和复杂社区提供三个综合工作流。我们描述各自的抽样和固定程序和优化染色协议的各个样本集。本文以复杂的研究为中心, 以应用为重点的平台顶部设备, 描述了细胞分类程序, 并提出了数据分析包, 细胞分析。此外, 我们还提出了重要的实验控制, 并将所提出的工作流应用于相应的样本集。
微生物在人类生活的许多方面起着至关重要的作用。它们是行星碳、氮、磷和硫循环1的主要生物驱动因素, 其作用是降解2、3以及在各种工业 (如废水处理) 中合成4用于生物催化剂。5或生物技术6。它们甚至构成了人类的微生物菌群, 直接影响到人类的健康和新陈代谢7,8。因此, 如果我们的目标是充分理解和操纵这些系统, 那么关于微生物的结构、功能和动态行为的信息, 以响应它们的直接环境是必要的。下一代测序技术是解决菌群结构和功能9的既定方法。但是, 对内部数据的分析和评估不能产生量化信息, 而且成本高昂, 耗时, 而且在性能走廊内也没有准备好提供现场结果。有些细菌在1小时以下显示世代时间并且导致经常改变的社区结构在某些环境10。在这样的动态下, 使用排序方法将超过大多数科学实验室的财务和人力能力。
相比之式细胞术可以提供类似于数据的社区指纹 , 同时保留更高的时间、劳动和成本效率。在这里, 我们提出的流动细胞技术能够遵循微生物群落动力学在网上的单一细胞水平。与本研究不同, 流式细胞术并不提供功能基因的系统进化隶属关系或信息, 而是提供定量的细胞数量。利用流式细胞仪, 可以将微生物群落分解为子社区, 具有明显的光散射和荧光特性 (前向散射 (FSC) 和侧散射 (SSC), 分别提供细胞大小和粒度的指示)。所提出的方法主要利用细胞大小和与某些细胞类型和生理 (生长) 状态相关的 DNA 数量相关信息。dna 含量的量化使用紫外兴奋 4 ‘, 6-diamidino-2 ‘-苯基吲哚 (DAPI) 染料, 它绑定到一个 T 丰富的地区的 DNA, 甚至可以解决不同的染色体水平。通过结合 DAPI 荧光和 FSC 超过50子社区可以区分和监测, 以改变丰度随着时间的推移11。子社区丰度变化可与微环境环境的变化相关, 如 pH 值和产品效价12, 具有全球参数, 如天气13,14, 或肠道或唾液的情况下微生物与某些医疗治疗15。这些相关性揭示了关键子社区负责在整个社区的新陈代谢网络中的特定功能。然后, 通过改变周围的微环境, 或者为随后的测序15或蛋白质组调查16进行排序, 可以特别促进或抑制关键子社区。
然而, 微生物群落流式细胞术还没有得到广泛的建立, 因为大量的流动细胞装置能够正确地解决微生物种群或群落。此外, 缺乏经验、社区分析管道和有效的数据评估可能会给面临微生物分析挑战的研究人员带来进入障碍。我们已经建立了全面的工作流程来解决这些问题。为了说明它们的一般适用性, 我们将在三示范样本集 (补充文件 1-S1) 上展示它们, 即 i) 一种纯文化 (PC), 用于在明确的培养基中生长的生物技术应用 (单胞菌恶臭KT 2440 上葡萄糖), ii) 在透明介质 (合成废水活性污泥群落 (ASC)) 和 iii) 的一个复杂的实验室社区, 从一个稠密基质 (BC) 的天然环境中的一个复杂的社区 (玉米青贮)。
几个因素影响了每个样本集的协议选择。深冻放弃使用有毒化学品, 但主要限于实验室环境, 因为使用液态氮气的冲击霜。甲醛稳定和随后的乙醇固定允许散装取样, 不需要整除准备, 并已证明是稳定的长期。然而, 富含蛋白质的样品如人唾液15可能是问题, 因为蛋白质絮凝体, denaturized 由甲醛, 可能导致不赞同的信号到噪声比率。样品干燥将花费多数时间 (大约 1 h 在一共) 过程在这个比较, 但可以在现场执行, 不用毒物化学制品。它在管子中产生稳定的颗粒, 可以很容易地运送而不冷却或额外的危险预防措施。此外, 还提出了许多替代固定方法11。在引入新的样本集时, 我们强烈建议测试不同协议的分辨率和固定稳定性。
我们使用了两个不同的流 cytometers 来分析集合: i) 一个高度复杂和昂贵的, 研究中心的细胞分拣器和 ii) 一个应用重点的台顶分析仪, 似乎更适合现场应用5。BC 用工作台顶部分析仪测量, 而 PC 和 ASC 用细胞分拣机测量。分析三示范样本集需要不同的程序, 以优化重现性, 样品稳定性和工作流程的方便。下面的协议将指定三不同系统的各部分。
对微生物种群和群落的成功分析需要经过良好调整的 cytometers, 适当的细胞参数选择, 以及从取样和固定到测量和数据评估的可靠工作流程。所选单元格参数必须与可用的激发波长匹配。我们使用和推荐 DAPI, 这是非常敏感的低浓度;但需要被紫外线激光激发, 这通常不包括在标准的细胞仪设置。其他染料, 如 SYBR 绿 I, 也玷污了整个人口或社区, 但一般提供劣质决议。我们不建议在微生物群落中使用鱼类程序或生存能力测试。这些方法无法量化、验证和控制, 因为它们对群落中个别物种的影响是不确定的。只要有相当一部分典型的社区仍然不能作为纯文化存在, 就无法对它们进行可靠的测试。
该协议的关键步骤包括取样和固定程序以及细胞分类。由于某些纯净的文化和微生物群落的倾向聚集到絮凝体或附着在样品基质中的微粒, 取样可能会变得复杂。在引入流细胞分析以保证可靠的结果之前, 必须在样品中消散这些聚集物并将细胞分离出来。对所提出的制备方案进行了优化, 以实现单细胞分析。最后50µm 过滤是在测量之前执行, 以去除任何残余骨料和防止70µm 喷嘴的细胞分拣器和流试管的分析仪从堵塞。污水处理厂的细胞絮凝体尤其丰富、健壮, 对系统的功能至关重要。对某大型污水处理厂不同储罐中的浮游污泥基微生物群落进行了研究, 对所建立的协议进行了测试。污泥形成细胞团聚体明显消散, 群落组成保持稳定。此外, 浮游和污泥为基础的群落在所有三取样罐中表现出显著的相似性 (图 8, 补充文件 1-S10)。这些结果通过比较 16S rDNA 扩增子测序的新鲜, 甲醛处理-, 甲醛和乙醇固定-, 和排序样本10验证。然而, 极具挑战性的环境样品, 如强的生物膜或在紧密相连的链条中生长的细菌, 可能无法消散。土壤样品可能是特别疑难的, 因为无处不在的微粒出现在直方图中, 并且可以通过纯粹的丰度掩盖细胞。在这种情况下, 需要采用传统的测序方法。
在设计实验前, 必须对每套新样品集的固定稳定性进行测试, 以保证结果的有效性。良好的固定稳定性也能在一天内使多样本时间点的汇集染色和测量。在实验结束和最后评价后, 它还能使复制测量和回溯细胞分类成为决定性的时间点。对纯培养物的固定稳定性进行了28天的验证 (图 9)。对于包括样品运输在内的现场试验, 应在较长时期内对固定稳定性进行试验 (在这种情况下, 活性污泥群落为60天, 沼气群落195天, 补充文件 1-S9)。
染色通常不是问题, 但需要控制与生物标准, 以允许应用的生物信息学评估工具。我们使用了模拟应变大肠杆菌BL21 (DE3), 这是根据 ASC 协议和储存, 以用于每一个染色批次。
除了 DAPI, SYBR 绿我已经成功地应用于解决微生物群落14 年,23,24,25,26。SYBR 绿色我可以用在线工作中的活细胞来解决社区变成高和低核酸子集 (海航和放大器)。然而, DAPI 在对 DNA 的结合上更具体, 并且在一个样本集合中能够区分超过50子社区, 但需要在染色前采取固定步骤。
细胞分类是这种方法的一个突出特点, 如果某些子社区有进一步的兴趣, 就可以应用。需要强调的是, 无论是粉煤灰 (仅执行30分钟), 还是乙醇处理或 DAPI 染色10都对随后的16S 扩增子测序产生负面影响。固定和染色程序对子社区 metagenome 分析的潜在影响仍需检验。
在涉及生物信息学工具的情况下, 许多关于社区功能和趋势动态的信息可以独立于分类方法中, 并通过细胞层次来解决虚拟细胞的社区特征, 并将这些特征参数。
最近, 一些新的生物信息学评估工具, 所有有用的 SYBR 绿色 I 和 DAPI 方法, 已开发解决细胞社区模式。这些是 FlowFP27, 这项研究中使用的包 (flowCHIC20, flowCyBar28), 一个与淡水社区29建立的反褶积模型和一个工具, 用于区分菌株根据其生理特征30。此外, 细胞多样性可以确定25 , 甚至微生物群落的稳定性特性现在可以遵循在线工具10。
因此, 在快速评价微生物群落和可能的非生物参数相关性方面, 流细胞分析具有巨大的优势。但是, 该方法仍然存在一些限制。由于有经验的基于门设置的程序, 它不能真正地在网上使用 flowCyBar 工具。此外, 研制定制、使用方便的流 cytometers 将极大地促进流细胞菌群分析方法的扩散。在这个方向上的第一步是进行28。
微生物流式细胞术的未来应用可以在微生物生态学中得到展望, 因为它允许在细菌产生时间范围内进行高频监测, 并表明生态学范式适用于细胞数据 5. ,10。该方法对在瑞士31的强制性饮水控制等自然环境的常规筛查非常有用。它也可以是一个宝贵的工具, 医疗应用, 如人类15或动物32微生物筛查。此外, 生物信息学的最新发展可能使微生物流式细胞术成为管理微生物系统过程控制中的一个整体传感器。微生物群落细胞术也为细胞分类提供了一个筛选工具, 它允许对特定群落子集进行更高分辨率的基因组调查。
The authors have nothing to disclose.
我们感谢迈克尔 Jahn 和黄玉庭提供了纯文化和活性污泥群落的程序和数据集。我们进一步感谢 Katrin Mörters 对沼气群落样品的分析。这项工作由 Fachagentur Nachwachsende Rohstoffe e (FNR, 项目沼气-指纹 Nr) 资助. 22008313) 代表德国联邦粮食和农业部 (BMEL), 联邦部中小企业的中央创新方案 (星)经济事务和能源 (BMWi) (INAR-ABOS, 16KN043222), 德意志 Bundesstiftung Umwelt (DBU, 项目按需 Produktion 冯 Phosphatdünger 澳大利亚的 Reststoffen 和 Brauerei 33960/01-32), 德国联邦教育部和研究 (BMBF) (FZK 03XP0041G) 和亥姆霍兹协会的面向项目的资金 (光纤 III R31 主题3生物能源)。
Milli-Q system Synthesis A10 | Merck, Darmstadt, (GER) | ||
BioPak Ultrafiltration Cartridge | Merck, Darmstadt, (GER) | CDUF BI0 01 | |
MoFlo Legacy cell sorter | Beckman-Coulter, Brea, California (USA) | ||
Innova 90C | Coherent, Inc , Santa Clara (USA) | 334 nm – 364 nm, 100 mW | |
Innova 70C | Coherent, Inc , Santa Clara (USA) | 488 nm, 400 mW | |
Genesis MX488-500 STM OPS | Coherent, Inc , Santa Clara (USA) | 488 nm, 400 mW | |
Xcyte CY-355-150 | Lumentum, Milpitas, California, USA | 355 nm, 150 mW | |
Photomultiplier tubes R928 and R3896 | Hamamatsu Photonics, Hamamatsu City (Japan) | ||
Summit 4.3 software | Beckman-Coulter, Brea, California (USA) | ||
1 µm FluoSpheres | Molecular Probes, Eugene, Oregon (USA) | F8815 | 350/440 blue fluorescent |
2 μm YG FluoSpheres | Molecular Probes, Eugene, Oregon (USA) | F-8827 | 505/515 yellow-green fluorescent beads |
0.5 μm Fluoresbrite BB Carboxylate microspheres | PolyScience, Niles, Illinois (USA) | 18339 | 360/407 |
1 μm Fluoresbrite BB Carboxylate microspheres | PolyScience, Niles, Illinois (USA) | 17458 | 360/407 blue fluorescent |
1 µmYG FluoSpheres | Molecular Probes, Eugene, Oregon (USA) | F-13081 | 505/515 yellow-green fluorescent beads |
KH2PO4 | Sigma-Aldrich, St. Louis (USA) | CAS no. 7778-77-0 | |
KCl | Sigma-Aldrich, St. Louis (USA) | CAS no. 7447-40-7 | |
Cyflow Space | Sysmex Corporation, Kobe (Japan) | ||
UV Laser Genesis CX, | Coherent, Inc , Santa Clara (USA) | 355 nm, 150 mW | |
H6779-32 series PMTs | Hamamatsu Photonics, Hamamatsu City (Japan) | ||
FloMax software | Sysmex Partec GmbH, Görlitz, (GER) | ||
all optical filters | Carl Zeiss, Jena (GER) | ||
KH2PO4 | Sigma-Aldrich, St. Louis (USA) | CAS no. 7778-77-0 | |
KCl | Carl Roth, Karlsruhe (GER) | 6781.3 | |
FlowJo 10.0.8r1 | FlowJo, LLC, Ashland, Oregon (USA) | Build number: 42398 | |
R-software v.3.4.3 | R Core Team | ||
flowCHIC | http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/flowCHIC.html | ||
flowCyBar | http://www.bioconductor.org/packages/devel/bioc/html/flowCyBar.html |