ניתוח תזרים cytometric הוכיח יקר עבור חוקרים תרבויות טהור וניטור dynamics הקהילה מיקרוביאלי. אנו מציגים שלוש זרימות עבודה מקיפה, מן הדגימה כדי ניתוח נתונים, עבור טהור תרבויות וקהילות מורכבים כמו גם ברורה בינוני כמו מטריצות מאתגר, בהתאמה.
החקירה של תרבויות טהור וניטור של הקהילה מיקרוביאלי dynamics חיוני להבין ולשלוט הטבעיות ויישומים טכניים מונע על ידי מיקרואורגניזמים. הדור הבא רצפי שיטות מנוצלים נרחב לפתרון microbiomes, אך הם בדרך כלל משאבים וזמן אינטנסיבית ולספק בעיקר מידע איכותי. ניתוח תזרים cytometric microbiome לא סובל את החסרונות האלה, מספקים abundances subcommunity יחסית ולא אבסולוטית תא מספרים ב- line. למרות שזה אינו להעביר מידע פילוגנטי ישירה, זה יכול לשפר את עומק ניתוח והרזולוציה של רצף גישות. בניגוד חריף ליישומים רפואיים מחקר והן הגדרות שגרתית, cytometry זרימה עדיין לא משמש עבור ניתוח microbiome. מידע חסר בצינורות ניתוח והכנה נתונים לדוגמה עלולים ליצור מחסום כניסה של החוקרים בפני אתגרים ניתוח microbiome זה יהיה לעיתים קרובות יישומים cytometry זרימה לפי הספר. כאן, אנו מציגים שלוש זרימות עבודה מקיפה על תרבויות טהור, מורכבות הקהילות נקה הקהילות בינוני ומורכבות מאתגרת מטריצות, בהתאמה. אנו מתארים דגימה בודדת ושגרות קיבוע, אופטימיזציה מכתים פרוטוקולים עבור ערכות מדגם בהתאמה. עלינו להרחיב את ניתוח cytometric עם מחקר מורכבות ממורכז, התקן העליון של ספסל ממוקד יישומים, לתאר את התא מיון הליך, מציע חבילות ניתוח נתונים. יתר על כן מציע פקדי ניסיוני חשוב ואנו חלות זרימות עבודה הציג את ערכות מדגם בהתאמה.
מיקרואורגניזמים ממלאים תפקיד חיוני בהיבטים רבים של אדם חי. הם המניעים העיקריים-ביוטי של כוכבי הלכת פחמן, חנקן, זרחן, גופרית מחזורים1, מעשה משפיל2,3 , וכן סינתזה biocatalysts4 בתעשיות שונות, כגון טיפול בשפכים 5 או ביוטכנולוגיה6. הם גם מהווים את microbiome האנושית, אשר ישירות המשפיעים על בריאות האדם ואת חילוף החומרים7,8. לכן, המידע על מבנה, תפקוד, התנהגות דינמית של מיקרואורגניזמים, בתגובה סביבתם הקרובה, היא הכרחית, אם אנו שואפים להבין ולטפל מערכות אלו באופן מלא. הדור הבא רצף (הגדרות) היא טכנולוגיה הוקמה ליישוב מבנה ותפקוד microbiome9. עם זאת, ניתוח והערכה של הגדרות נתונים לא יכולה להניב מידע כמותי, הוא עדיין יקר, זמן רב, בהחלט לא מוכנה לספק תוצאות באתר בתוך מסדרונות ביצועים. חיידקים מסוימים מציגים דור פעמים להלן 1 h ולגרום ללא הרף הקהילה מבנים מסוימים סביבות10. בעקבות דינמיקה כזאת, שימוש בגישות רצף עולה על הקיבולת פיננסי, כוח העבודה של מעבדות ביותר.
לעומת זאת, cytometry זרימה יכול לספק טביעות הקהילה דומים לנתוני המיתרים, תוך שמירה על יעילות גבוהה יותר של הזמן-, העבודה – ועלות. כאן, אנו מציגים את הזרימה cytometric טכניקות מצליח לעקוב הקהילה מיקרוביאלי דינמיקה ב- line על רמת תא בודד. בניגוד המיתרים, cytometry זרימה אינו מספק פילוגנטי השתייכות או מידע על גנים פונקציונלי, אך מספק מספרי הטלפון הנייד כמותית. באמצעות cytometry זרימה, ניתן לפתור קהילות חיידקים לתוך subcommunities עם פיזור אור שונות ומאפייני קרינה פלואורסצנטית (פיזור קדמי (FSC) ופיזור צד (האס) לספק אינדיקציות של גודל תא, צפיפות, בהתאמה). הגישה הציג מנצל בעיקר גודל התא -, DNA כמות מידע קשור הקשורות סוגי תאים מסוימים, מצבים פיזיולוגיים (צמיחה). תוכן ה-DNA הוא לכמת באמצעות UV-טמפרמנט 4′, 6-diamidino-2′-phenylindole (דאפי) צבע, אשר נקשר לאזורים עשירים A-T של ה-DNA, ניתן לפתור אפילו רמות כרומוזומליות שונות. על-ידי שילוב קרינה פלואורסצנטית דאפי FSC subcommunities יותר מ-50 יכול להיות מכובד, פיקוח על שינוי abundances זמן11. הווריאציות שפע subcommunity ישויך עם שינויים בסביבה מיקרו-סביבתי, כגון pH והמוצר titers12, עם פרמטרים הכללית, כגון מזג אוויר13,14, או במקרה של הבטן או רוק microbiomes עם טיפולים רפואיים מסוימים15. מתאמים אלה חושפים אחראי לתפקודים מסוים ברשת מטבולית של הקהילה כל מפתח subcommunities. Subcommunities מפתח שניתן ואז במיוחד קידום או ודוכאה על-ידי שינוי המיקרו-בסביבה או מיינת לשם רצף עוקבות15 או פרוטיאומיה מבנית החקירה16.
עם זאת, הקהילה מיקרוביאלי cytometry זרימה לא עדיין נרחב נוסדה במספר נמוכות למדי זרימת cytometric התקנים היכולים לפתרון אוכלוסיות חיידקים או קהילות כראוי. יתר על כן, חוסר ניסיון, הקהילה צינורות ניתוח והערכה נתונים יעיל עלולה להוות מכשול כניסה לחוקרים מול אתגרים ניתוח microbiome. הקמנו זרימות עבודה מקיפה כדי להתמודד עם בעיות אלה. כדי להמחיש את תחולת כללי, נביא אותם על שלוש קבוצות דוגמה למופת (קובץ משלים 1-S1), כלומר אני) תרבות טהור (PC) ליישומים ביוטכנולוגי גדל מוגדרים ברורים בינוני (Pseudomonas putida KT 2440- גלוקוז), ii) קהילה מעבדה מורכבים ברור בינוני (בוצה מופעל בקהילה (ASC) בשפכים סינתטי) ו- iii) קהילה המורכבים של סביבות טבעיות במטריצה צפוף (ביוגז בקהילה (לפנה ס) תחמיץ תירס).
מספר גורמים להשפיע על בחירת פרוטוקול עבור כל אחד ערכות דוגמת אלה. הקפאה עמוקה forgoes את השימוש בכימיקלים רעילים אבל בעיקר מוגבל סביבות מעבדה עקב השימוש של חנקן נוזלי עבור ציפוי הלם. אתנול עוקבות וייצוב פורמלדהיד קיבוע מאפשר נפח דגימה ללא צורך הכנה aliquot, הוכיחה להיות יציב לאורך זמן.. עם זאת, דגימות עשירים בחלבון כמו רוק אנושי15 ייתכן בעייתי, כי חלבון flocs, denaturized מאת הפורמלדהיד, עלול לגרום שלילי אות רעש יחסי. ייבוש מדגם יקח הזמן הרב ביותר (כ 1 ח סה כ) של ההליכים בהשוואה זו, אך ניתן לבצע באתר ללא כימיקלים רעילים. זה מניב כדורי יציב צינורות, אשר ניתן לשלוח בקלות ללא קירור או נוספים הזהירות הזארד. בנוסף, היו המון שיטות קיבוע חלופי המוצע11. אנו ממליצים לבחון את יציבות קיבוע של רזולוציה של פרוטוקולים שונים כאשר מציגים סט מדגם חדש.
. היינו שני cytometers זרימה שונים כדי לנתח את ערכות: i) מחקר מאוד מתוחכמת ויקרה, ממורכז סדרן התא ו- ii) של היישום התמקד ספסל העליון מנתח אשר מופיע מתאים יותר עבור יישום באתר5. ה לפנה ס נמדדה עם מנתח העליון הספסל, בעוד המחשב ואת ASC נמדדו עם סדרן התא. הניתוח של המדגם למופת שלוש הגדרת ההליכים שונים הנדרשים עבור אופטימיזציה הפארמצבטית, דוגמת יציבות ונוחות זרימת העבודה. פרוטוקול הבאים יציינו את המקטעים עבור שלוש מערכות שונות.
ניתוח מוצלח של אוכלוסיות חיידקים וקהילות דורש cytometers היטב, הבחירה המתאימה של התא בפרמטרים של זרימת עבודה אמינים הדגימה, קיבוע לכיוון להערכה מדידה ונתונים. הפרמטרים התא שנבחר חייבים להתרועע עם אורכי הגל עירור זמינים. אנחנו משתמשים וממליצים דאפי, אשר הוא מאוד רגיש בריכוזים נמוכים; אבל צריך להיות נרגש UV-לייזר, אשר לא מורכבת בדרך כלל ב- set-ups cytometer רגיל. צבעים אחרים, כגון SYBR ירוק אני, גם אוכלוסיות כל כתם או קהילות אבל בדרך כלל לספק החלטות נחות. לא מומלץ להשתמש דגים הליכים או בדיקות הכדאיות בקהילות מיקרוביאלי. הגישות הללו הן בלתי אפשרי לכמת, ודא ולשלוט בגלל השפעתם על מינים בודדים בקהילה אינו ברור. הם לא אמינה להיבדק, כל עוד חלק ניכר של הקהילות טיפוסי הוא עדיין לא זמין כתרבות טהור.
שלבים קריטיים בפרוטוקול כוללים שגרות דגימה וקיבוע, כמו גם מיון תא. יכול להיות מסובך הדגימה הנטייה של מסוימים טהור תרבויות וקהילות מיקרוביאלי צבירה כדי flocs או לדבוק חלקיקים של המטריקס מדגם. זה חיוני כדי להפיג אלה אגרגטים ולהפריד את התאים במדגם לפני להם היכרות עם ניתוח תזרים cytometric כדי להבטיח תוצאות אמינות. הפרוטוקולים הכנה הציג אופטימציה כדי לאפשר ניתוח תא בודד. סינון סופי 50 מיקרומטר מבוצע לפני המדידה כדי להסיר את כל אגרגטים שיורית ולמנוע הזרבובית מיקרומטר 70 של סדרן התא, cuvette את הזרימה של מנתח וסותם. תא flocs של שפכים הן שופע במיוחד, עמיד וחיוני לתפקוד של המערכת. . חקרנו את יצורי ומבוססות בוצה קהילות מיקרוביאלי במיכלים שונים של צמח טיפול בשפכים בהיקף מלא, כדי לבדוק את פרוטוקול הוקמה. את כל הטינופת ויוצרים תא אגרגטים היו בבירור התפוגג, הרכב הקהילה נותר יציב. יתר על כן, קהילות פלנקטוניים מבוססי בוצה הפגינו דמיון ראוי לציון ביניהם כל שלושה טנקים שנדגמו (איור 8, הקבצים המשלימים 1-S10). תוצאות אלה אומתו על ידי מטוסי אף-16 השוואתי rDNA אמפליקון רצף של טרי-, פורמלדהיד שטופלו-, הפורמלדהיד והאתנול מקובע-, ו מדגם ממוינים10. בכל זאת, באופן יוצא דופן מאתגר דגימות סביבתיים, כגון biofilms חזק או חיידקים הגדלים רשתות מחוברות בחוזקה, יכול להיות אפשרי להתפוגג. דגימות. אדמה יכול להיות בעייתי במיוחד, כפי החלקיקים בכל מקום מופיעים ההיסטוגרמה, ניתן להסתיר את התאים על ידי השפע העצום. במקרים כאלה, שיטות מסורתיות רצף צריכים להיות מיושמים.
היציבות קיבוע של כל ערכה מדגם חדש צריך להיבדק לפני שתעצב את הניסוי כדי להבטיח תוצאה תוקפו. קיבוע טוב יציבות גם מאפשר את במאגר מכתים ומדידה של נקודות זמן דגימה מרובות ביום אחד. הוא מאפשר יתרה מזאת שכפול ומדידות, מיון תא רטרוספקטיבה של נקודות זמן מכריע לאחר סיכום והערכה הסופי של הניסוי. היציבות קיבוע של התרבות טהור אומתה במשך 28 ימים (איור 9). לניסויים באתר כולל הובלה מדגם, יציבות קיבוע צריך להיבדק על פני תקופות ארוכות יותר (במקרה זה, 60 ימים עבור הקהילה בוצה מופעל, 195 ימים עבור הקהילה ביוגז, הקבצים המשלימים 1-S9).
ההכתמה היא בדרך כלל לא בעייתית אבל צריך להיות נשלט עם תקן ביולוגי כדי לאפשר יישום של כלי הערכה של bioinformatic. השתמשנו המתח מדומה e. coli BL21 (DE3), אשר היה מקובעים לפי הפרוטוקול עולה, ואמצעי לשימוש אצוה מוכתמים.
מלבד דאפי, SYBR Green אני יושם בהצלחה כדי לפתור קהילות חיידקים במשך מספר שנים14,23,24,25,26. SYBR Green יכול לפתור קהילות לערכות חומצת גרעין – גבוה ונמוך (HNA ומגבר קדם) באמצעות תאים חיים ב מודוס באינטרנט. דאפי, אולם באופן שלה מחייב דנ א ספציפי יותר, מאפשר את ההבחנה subcommunities מעל 50 בערכת דוגמא אחת אלא דורש שלב קיבוע לפני צביעת.
מיון תא תכונה יוצאת דופן של גישה זו, יכול להיות מיושם אם subcommunities מסוימים אינם עניין נוסף. זה צריך להדגיש כי גם מחברים-(מתבצעות רק 30 דקות) ולא טיפול אתנול או דאפי מכתים10 היה השפעה שלילית על הרצף אמפליקון 16 עוקבות. פוטנציאל ההשפעות של הקיבעון, צביעת הליכים אודות subcommunity metagenome ניתוחים עדיין צריך להיבדק.
הרבה מידע על פונקציות הקהילה ואת הדינמיקה המגמה ניתן להשיג עצמאית מן הגישה מיון כאשר מעורבים ושפור לפתור תכונות קהילתיות ברמת התא על-ידי התא וירטואלי, להתחבר תכונות אלה עם והאביוטיים פרמטרים.
לאחרונה, מספר של ביואינפורמטיקה הערכה כלים חדשים, כל שימושי עבור שניהם SYBR ירוק, ואני את הגישות דאפי, פותחו כדי לפתור תבניות הקהילה cytometric. . אלו FlowFP27, החבילות השתמשו במחקר זה (flowCHIC20, flowCyBar28), מודל deconvolution הקים עם מים מתוקים קהילות29 , כלי המשמש להפלות זנים על פי שלהם פיזיולוגיים מאפייני30. בנוסף, גיוון cytometric יכול להיות נחוש25 , יציבות אפילו מאפיינים של קהילות חיידקים יכולים לבוא עכשיו עם כלי מקוון10.
לפיכך, הזרימה cytometric ניתוחים יש יתרון עצום כשמדובר ראפיד הערכה של קהילות מיקרוביאלי, מתאמים פרמטר והאביוטיים אפשרי. עם זאת, קיימות עדיין מגבלות לשיטה. זה אין אפשרות להחיל באמת באינטרנט באמצעות הכלי flowCyBar, בשל ההליך הגדרת שער בסיס מנוסים. יתר על כן, הפיתוח של זרימה מחוייט, קל לשימוש cytometers במידה רבה מראש ההתפשטות של הגישה ניתוח זרימת microbiome cytometric. צעדים ראשונים בכיוון זה הם להתבצע28.
יישומים עתידיים של cytometry זרימה חיידקים יכולים להיות שנחזה ב אקולוגיה מיקרוביאלית, זה מאפשר בתדירות גבוהה ניטור בטווח של דור חיידקי פעמים, הוכח כי פרדיגמות אקולוגית הינם ישימים לנתונים cytometric5 ,10. השיטה היא מאוד שימושי עבור הקרנות שגרתית של סביבות טבעיות כמו הפקדים חובה שתיית מים שוויץ31. זה גם יכול להיות כלי רב ערך עבור יישומים רפואיים כמו האדם15 או בעלי חיים32 microbiome ההקרנה. בנוסף, ההתפתחויות האחרונות בביואינפורמטיקה עשוי לאפשר cytometry זרימה מיקרוביאלי להיות בחיישני אינטגרלי בפקדים תהליך של מערכות מיקרוביאלי מנוהלים. הקהילה מיקרוביאלי cytometry מספק גם כלי סינון למיון התא, אשר מאפשר רזולוציה גבוהה יותר חקירות גנומית של קהילה ספציפי קבוצות משנה.
The authors have nothing to disclose.
אנו להכיר בהכרת תודה מייקל, פרי יוטינג גואו למתן את ההליך ואת datasets טהור התרבות והקהילה בוצה מופעל, בהתאמה. אנו מודים נוספים קתרין Mörters לניתוח הדגימות הקהילה ביוגז. עבודה זו מומן על ידי אי Fachagentur Nachwachsende Rohstoffe נ’ (FNR, פרוייקט ביוגז-טביעות אצבעות Nr. 22008313) מטעם המשרד הפדרלי הגרמני עבור מזון, חקלאות (BMEL), התכנית חדשנות מרכזי עבור חברות קטנות ובינוניות (צים) של המשרד הפדרלי בכלכלה ואנרגיה (BMWi) (INAR-ABOS, 16KN043222), דויטשה Bundesstiftung Umwelt (DBU, פרוייקט לפי דרישה הפקה פון Phosphatdünger שעון Reststoffen פון Brauerei und Kläranlage 33960/01-32), המשרד הפדרלי הגרמני לחינוך, (BMBF) (FZK 03XP0041G), ומחקר של העמותה הלמהולץ מונחה תוכנית מימון (POF השלישי R31 נושא 3 Bioenergy).
Milli-Q system Synthesis A10 | Merck, Darmstadt, (GER) | ||
BioPak Ultrafiltration Cartridge | Merck, Darmstadt, (GER) | CDUF BI0 01 | |
MoFlo Legacy cell sorter | Beckman-Coulter, Brea, California (USA) | ||
Innova 90C | Coherent, Inc , Santa Clara (USA) | 334 nm – 364 nm, 100 mW | |
Innova 70C | Coherent, Inc , Santa Clara (USA) | 488 nm, 400 mW | |
Genesis MX488-500 STM OPS | Coherent, Inc , Santa Clara (USA) | 488 nm, 400 mW | |
Xcyte CY-355-150 | Lumentum, Milpitas, California, USA | 355 nm, 150 mW | |
Photomultiplier tubes R928 and R3896 | Hamamatsu Photonics, Hamamatsu City (Japan) | ||
Summit 4.3 software | Beckman-Coulter, Brea, California (USA) | ||
1 µm FluoSpheres | Molecular Probes, Eugene, Oregon (USA) | F8815 | 350/440 blue fluorescent |
2 μm YG FluoSpheres | Molecular Probes, Eugene, Oregon (USA) | F-8827 | 505/515 yellow-green fluorescent beads |
0.5 μm Fluoresbrite BB Carboxylate microspheres | PolyScience, Niles, Illinois (USA) | 18339 | 360/407 |
1 μm Fluoresbrite BB Carboxylate microspheres | PolyScience, Niles, Illinois (USA) | 17458 | 360/407 blue fluorescent |
1 µmYG FluoSpheres | Molecular Probes, Eugene, Oregon (USA) | F-13081 | 505/515 yellow-green fluorescent beads |
KH2PO4 | Sigma-Aldrich, St. Louis (USA) | CAS no. 7778-77-0 | |
KCl | Sigma-Aldrich, St. Louis (USA) | CAS no. 7447-40-7 | |
Cyflow Space | Sysmex Corporation, Kobe (Japan) | ||
UV Laser Genesis CX, | Coherent, Inc , Santa Clara (USA) | 355 nm, 150 mW | |
H6779-32 series PMTs | Hamamatsu Photonics, Hamamatsu City (Japan) | ||
FloMax software | Sysmex Partec GmbH, Görlitz, (GER) | ||
all optical filters | Carl Zeiss, Jena (GER) | ||
KH2PO4 | Sigma-Aldrich, St. Louis (USA) | CAS no. 7778-77-0 | |
KCl | Carl Roth, Karlsruhe (GER) | 6781.3 | |
FlowJo 10.0.8r1 | FlowJo, LLC, Ashland, Oregon (USA) | Build number: 42398 | |
R-software v.3.4.3 | R Core Team | ||
flowCHIC | http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/flowCHIC.html | ||
flowCyBar | http://www.bioconductor.org/packages/devel/bioc/html/flowCyBar.html |