Tam kan örneklerinde virüs tespiti için hızlı, güvenli ve basit el ile başucu nükleik asit çıkarma
Summary
Burada, bir protokol virüsü inaktive tam kan rapid virüs nükleik asit çıkarılması için mevcut. Çıkarma doğrudan kan toplama tüplerde gerçekleştirilir ve hiçbir ekipman veya elektrik gerektirir. Yöntem ve laboratuvar olanakları üzerinde bağımlı değildir olabilir herhangi bir yere (Örneğin, alan hastanelerde) kullanılır.
Abstract
Hızlı tanı bir enfeksiyonu salgını yönetimi, risk çevreleme ve hasta bakımı için önemlidir. Biz daha önce Ebola virüsü hızlı başucu inactivation güvenli nükleik asit (NA) testleri için kan örnekleme sırasında için bir yöntem bir ticari lizis/bağlayıcı arabelleğe doğrudan vakum kan toplama tüpler içine ekleyerek göstermiştir. Bu başucu inactivation yaklaşımı kullanarak, bir güvenli, hızlı ve Basitleştirilmiş başucu NA çıkarma yöntemi bir virüs lizis/bağlama arabellek inaktive tam kan içinde sonraki tespiti için geliştirdik. NA çıkarma doğrudan kan toplama tüplerde gerçekleştirilir ve hiçbir ekipman veya elektrik gerektirir.
Kan lizis/bağlayıcı arabelleğe toplandıktan sonra içeriği el ile tüp lanetleme tarafından karışık ve karışımı oda sıcaklığında 20 dakika inkübe. Manyetik cam parçacıkları (MGPs) tüp eklenir ve içeriği el ile toplama tüp saygısız karıştırılır. MGPs sonra bir manyetik tutucu veya bir mıknatıs ve bir lastik bant kullanarak kan toplama tüp tarafında toplanır. MGPs üç kez yıkanır ve toplama tüp içine doğrudan elüsyon arabellek eklenmesinden sonra NAs qPCR veya izotermal döngü amplifikasyon (lamba), reaksiyon gelen MGPs kaldırılması olmadan gibi NA testler için hazırız. NA çıkarma yöntemi herhangi bir laboratuvar olanakları üzerinde bağımlı değildir ve kolayca herhangi bir yere (Örneğin, alan hastaneler ve hastane yalıtım wards) kullanılır. Bu NA çıkarma yöntemi lamba ve taşınabilir alet ile birleştirildiğinde, bir tanı kan toplama 40 dk içinde elde edilebilir.
Introduction
Virüs salgını durumlarda hastaların hastane yalıtım wards veya hızlı tanı gerekli olduğunda, sınırlı zaman güvenli, basit ve doğru bakım noktası moleküler tanı hasta bakım ve risk çevreleme için zorunludur. İki son virüs salgınları, Ebola virüsü (EBOV) Batı Afrika’da (2013) ve Güney Amerika (2015), Zika virüs geliştirilmiş bakım noktası moleküler tanı testleri, Ters transkripsiyon döngü-aracılı İzotermik gibi ilgi arttı amplifikasyon (RT-lamba)1,2 ve recombinase polimeraz amplifikasyon (RPA)3,4. RT-lamba ve RPA Basitleştirilmiş örnek hazırlıkları üzerinde gerçekleştirilebilecek hızlı, hassas ve belirli moleküler testlerdir. Zika virüs için RT-lamba Zika virüs olmayan saf tam kan örneklerinde 30 dk1içinde tespit edebilen bir yanal akışı tahlil (LFA), ile birlikte; Ancak, bir risk grubu 4 patojen sınıflandırılır ve çok bulaşıcı, EBOV örnekleri Biyogüvenlik altında ele alınması gerekir 4 (BSL-4) koşulları düzey ve güvenli herhangi bir tanı yöntemleri uygulanmadan önce inaktive olur.
Örnek2,3,4,5, lizis arabellekleri eklenmesi gibi EBOV için Basitleştirilmiş inactivation yöntemleri salgını sırasında kullanılması; Ancak, bu yöntemler ile Laboratuar donanımları, BSL-3 Biyogüvenlik kabinleri, santrifüj, Isıtma blokları ve Pipetler, en azından gibi BSL-4 koşulları altında işlem gerektirir. Bu ekipman yalıtım koğuşlarında ya alan hastaneler mevcut değil normal. Bu zorluğu aşmak için bavul3‘ te gerçekleştirin teşhis için yapılan girişimleri ve birkaç taşınabilir cihazlar ve makineleri gelişmiş [Örneğin, nükleik asit (NA) çıkarılması için taşınabilir bir aygıta] olmuştur6. Ancak, EBOV-pozitif örnekleri hala bu cihazların kullanılabilmesi için önce inaktive gerekir.
Biz daha önce bir hızlı başucu virüs inactivation yöntemi EBOV7, vaksinia virüs ve ineklerde virüs8 için buna ek olarak bir ticari lizis/bağlama arabellek tarafından sıradan vakum kan toplama tüpler için doğrudan için izin bildirdin hastanın transfer kan inactivation arabellek7içine. Bu doğrudan ve anında inactivation kapalı bir sistem içinde BSL-4 koşullar7gibi herhangi bir sıkı koruma kullanarak örnekleri işleme gereksinimini ortadan kaldırır ve örnekleri normal BSL-2 şartlar altında ele alınabilir. Bu inactivation Yöntem robotlar ve el arıtma kitleri7gibi birkaç NA emme tesisleri ile uyumludur; Ancak, bu yöntemler laboratuvar donanımları, robotlar, santrifüj ve elektrik, her zaman mevcut alan ayarları veya hastane yalıtım wards değil gibi gerektirir.
Bu raporda, bir güvenli, hızlı ve Basitleştirilmiş el ile NA çıkarma yöntemi bir virüs lizis/bağlama arabellek inaktive tam kan içinde sonraki moleküler tespiti için açıklar. NA çıkarma yöntemi bir mıknatıs/manyetik tutucu dışında herhangi bir donanım gerektirmez. Santrifüjler blok veya elektrik Isıtma, NA çıkarma için ihtiyaç vardır. Bu nedenle, bu yöntem ve laboratuvar olanakları üzerinde bağımlı değildir kolayca herhangi bir yere (Örneğin, alan hastaneler, hastane yalıtım Wards veya düşük kaynak ayarları ile) kullanılır. NA çıkarma yöntemi hızlı ve basit ve doğrudan testlerde herhangi bir aşağı akım NA, qPCR, RT-qPCR, lamba veya RT-lamba gibi kullanılabilir. Bu NA çıkarma yöntemi lamba ve taşınabilir bir pil tahrik izotermal aleti ile birleştirildiğinde, başucu tanı kan toplama 40 dk içinde elde edilebilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu raporda, bir güvenli, hızlı ve basit el ile başucu NA çıkarma yöntemi lizis/bağlama arabellek inaktive tam kan virüs aşağı akım moleküler tespiti için açıklar. Açıklanan NA çıkarma yöntemi doğrudan lizis/bağlama arabellek (Tablo reçetesi)7içeren vakum kan toplama tüplerde toplanan tam kan örnekleri üzerinde gerçekleştirilen için geliştirilmiştir. Bu belirli bir arabellek EBOV7 inaktive ve yöntem kritik bileşenidir. Kan…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz Susanne Lopes Rasmussen ve Solvej Kolbjørn Jensen teknik yardım ve klinik örnekleri işleme için teşekkürler. Bu proje finansman yenilikçi ilaç girişimi 2 ortak girişim Hibe Sözleşmesi N ° 115843 altında aldı EbolaMoDRAD Konsorsiyumu bir parçasıdır. Bu ortak girişim, Avrupa Birliği’nin ufuk 2020 araştırma ve yenilik programı ve EFPIA destek alır.
Materials
| Vacutainer K2 EDTA tubes (4 mL) | Becton Dickinson | 368861 | |
| Plus Blood Collection | Becton Dickinson | 362725 | |
| 23G x 1 needle | Becton Dickinson | 300800 | |
| LUER LOK syringe (3 mL) | Becton Dickinson | 309658 | |
| Butterfly needle with small-bore extension tubing | Jørgen Kruuse A/S | 121714 | |
| 1% Virkon | Nomeco A/S | 849265 | |
| MagNA Pure LC DNA Isolation Kit I – Lysis/Binding Buffer – Refill | Roche Diagnostics A/S | 03246752001 | |
| MagNA Pure LC Total Nucleic Acid Isolation Kit | Roche Diagnostics A/S | 3038505001 | |
| Nunc™ Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes (1,8 mL) | Thermo Fisher Scientific | 375418 | |
| Nunc™ Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes (3,6 mL) | Thermo Fisher Scientific | 379189 | |
| Nunc™ Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes (4,5 mL) | Thermo Fisher Scientific | 379146 | |
| DynaMag™-5 Magnet | Thermo Fisher Scientific | 12303D | |
| Transfer pipette (3.5 mL) | Sarstedt | 86.1171.010 | |
| Thermo Scientific™ Samco™ Fine Tip Transfer Pipettes (1.5 mL) | Thermo Fisher Scientific | 231 | |
| Thermo Scientific™ Nunc™ 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 339652 |
References
- Lee, D., Shin, Y., Chung, S., Hwang, K. S., Yoon, D. S., Lee, J. H. Simple and Highly Sensitive Molecular Diagnosis of Zika Virus by Lateral Flow Assays. Analytical Chemistry. 88, 12272-12278 (2016).
- Benzine, J. W., Brown, K. M., et al. Molecular Diagnostic Field Test for Point-of-Care Detection of Ebola Virus Directly from Blood. Journal of Infectious Diseases. 214 (Suppl 3), S234-S242 (2016).
- Faye, O., Faye, O., et al. Development and deployment of a rapid recombinase polymerase amplification Ebola virus detection assay in Guinea in 2015. Euro Surveillance. 20 (44), 10-18 (2015).
- Yang, M., Ke, Y., et al. Development and Evaluation of a Rapid and Sensitive EBOV-RPA Test for Rapid Diagnosis of Ebola Virus Disease. Scientific Reports. 6, (2016).
- Smither, S. J., Weller, S. A., et al. Buffer AVL alone does not inactivate Ebola virus in a representative clinical sample type. Journal of Clinical Microbiology. 53 (10), 3148-3154 (2015).
- Byrnes, S., Fan, A., et al. A Portable, Pressure Driven, Room Temperature Nucleic Acid Extraction and Storage System for Point of Care Molecular Diagnostics. Analytical Methods. 5 (13), 3177-3184 (2013).
- Rosenstierne, M. W., Karlberg, H., et al. Rapid bedside inactivation of Ebola virus for safe nucleic acid tests. Journal of Clinical Microbiology. 54 (10), 2521-2529 (2016).
- Vinner, L., Fomsgaard, A. Inactivation of orthopoxvirus for diagnostic PCR analysis. Journal of Virological Methods. 146, 401-404 (2007).
- Schmitz, H., Köhler, B., et al. Monitoring of clinical and laboratory data in two cases of imported Lassa fever. Microbes and Infection. 4 (1), 43-50 (2002).
- De La Vega, M. A., Caleo, G., et al. Ebola viral load at diagnosis associates with patient outcome and outbreak evolution. Journal of Clinical Investigation. 125 (12), 4421-4428 (2015).
- Hasanoglu, I., Guner, R., et al. Dynamics of viral load in Crimean Congo hemorrhagic fever. Journal of Medical Virology. 90 (4), 639-643 (2017).
- Biava, M., Colavita, F., et al. Evaluation of a rapid and sensitive RT-qPCR assay for the detection of Ebola Virus. Journal of Virological Methods. 252, 70-74 (2018).
- Fernández-Carballo, B. L., McBeth, C., et al. Continuous-flow, microfluidic, qRT-PCR system for RNA virus detection. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 410 (1), 33-43 (2017).
- Weller, S. A., Bailey, D., et al. Evaluation of the Biofire FilmArray Biothreat E-test (v2.5) for rapid identification of Ebola virus disease in heat-treated blood samples obtained in Sierra Leone and United Kingdom. Journal of Clinical Microbiology. 54 (1), 114-119 (2015).
- Semper, A. E., Broadhurst, M. J., et al. Performance of the GeneXpert Ebola Assay for Diagnosis of Ebola Virus Disease in Sierra Leone: A Field Evaluation Study. PLoS Medicine. 13 (3), e1001980 (2016).
- Biocartis. . Instructions for Use: Idylla TM Ebola Virus Triage Test. , (2016).
- MPLC. . Total Nucleic Acid Isolation Kit. Safety data sheet version 1.7. , (2015).
