Snelle, veilige en eenvoudige handleiding bed nucleïnezuur extractie voor de opsporing van Virus in monsters van volbloed
Summary
Hier presenteren we een protocol voor de snelle virus nucleïnezuur extractie van de volbloed virus-geïnactiveerd. De winning gebeurt rechtstreeks in het bloed collectie buizen en vereist geen apparatuur of elektriciteit. De methode is niet afhankelijk van laboratoriumfaciliteiten en kan overal worden gebruikt (bijvoorbeeld, in veldhospitalen).
Abstract
De snelle diagnose van een infectie is essentieel voor de uitbraak beheer risico insluiting en de patiëntenzorg. Wij hebben eerder een methode voor de snelle bed inactivering van het Ebola-virus tijdens bloedmonsters voor veilige nucleïnezuur (nvt) tests getoond door het toevoegen van een buffer van commerciële lysis/bindende rechtstreeks in de vacuüm bloed collectie buizen. Gebruik deze bed inactivatie-aanpak, hebben we ontwikkeld een veilige, snelle en vereenvoudigde bed nb extractiemethode voor de latere detectie van een virus in cellysis/bindende buffer-geïnactiveerd volbloed. De NA extractie gebeurt rechtstreeks in het bloed collectie buizen en vereist geen apparatuur of elektriciteit.
Nadat het bloed is verzameld in de buffer lysis/bindende, de inhoud door het omkeren van de buis met de hand worden gemengd en het mengsel wordt gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur geïncubeerd. Magnetische glas deeltjes (MOP’s) worden toegevoegd aan de buis, en de inhoud zijn gemixt door het omkeren van de buis van de collectie met de hand. De meerjarige oriëntatieprogramma’s worden vervolgens verzameld aan de zijkant van de bloed collectie buis met behulp van een Paperclip Magneethouder of een magneet en een rubberen band. De meerjarige oriëntatieprogramma’s zijn drie keer gewassen, en na de toevoeging van elutie buffer rechtstreeks in de collectie buis, de NAs zijn klaar voor NA proeven, zoals qPCR of lus isotherme amplificatie (LAMP), zonder de verwijdering van de meerjarige oriëntatieprogramma’s uit de reactie. De nb-extractiemethode is niet afhankelijk van enige laboratoriumfaciliteiten en kan gemakkelijk worden overal gebruikt (bijvoorbeeld, in veldhospitalen en ziekenhuis isolatie wijken). Wanneer deze NA-extractiemethode wordt gecombineerd met LAMP en een draagbare instrument, kan een diagnose binnen 40 min van de bloedinzameling worden verkregen.
Introduction
Virus uitbraak situaties, wanneer patiënten zijn beperkt tot het ziekenhuis isolatie afdelingen of wanneer een snelle diagnose nodig is, is een veilige, eenvoudige en nauwkeurige point-of-care moleculaire diagnostiek absoluut noodzakelijk dat de patiënt zorg en risico insluiting. De twee recente virale uitbraken, van het Ebola-virus (EBOV) in West-Afrika (2013) en het Zika-virus in Zuid-Amerika (2015), is de belangstelling voor verbeterde point-of-care aan moleculaire diagnostische tests, zoals omgekeerde transcriptie lus-gemedieerde isotherme gestegen versterking (RT-LAMP)1,2 en recombinase polymerase versterking (RPA)3,4. RT-LAMP én RPA zijn snelle, gevoelige en specifieke moleculaire tests die kunnen worden uitgevoerd op vereenvoudigde staalvoorbereiding. Voor de Zika-virus, heeft RT-LAMP is gecombineerd met een laterale stroom assay (LFA), die Zika-virus in monsters van volbloed niet-gezuiverd binnen 30 min1 detecteren kan; echter, voor EBOV, die is ingedeeld als een risico groep 4 pathogeen en is zeer besmettelijk, de monsters moeten worden behandeld onder bioveiligheid niveau 4 (BSL-4) voorwaarden en geïnactiveerd alvorens een veilige diagnostische procedures kunnen worden uitgevoerd.
Vereenvoudigde inactivatie methoden voor EBOV, zoals de toevoeging van lysis buffers naar de monster2,3,4,5, werden gebruikt tijdens de uitbraak; echter, deze methoden vereisen behandeling onder BSL-4 voorwaarden met laboratoriumapparatuur, zoals BSL-3 bioveiligheid kasten, centrifuges, Verwarming blokken en pipetten, minimaal. Deze apparatuur is normaal niet aanwezig in isolatie wijken of in veldhospitalen. Om te overwinnen deze uitdaging, pogingen hebben gedaan voor het uitvoeren van diagnostiek in koffers3en diverse draagbare apparaten en machines zijn ontwikkelde [bijvoorbeeldeen draagbaar apparaat voor de extractie van nucleïnezuur (nvt)]6. EBOV-positieve monsters moeten echter nog worden geïnactiveerd voordat deze apparaten kunnen worden gebruikt.
We hebben eerder gemeld een snelle bed virus inactivatie methode voor de EBOV7, vacciniavirus en Koepokken virus8 door toevoeging van een commerciële lysis/bindende buffer gewone vacuüm bloed collectie buizen, waardoor voor de rechtstreekse overdracht van bloed van de patiënt in de inactivering buffer7. Deze directe en onmiddellijke inactivatie in een gesloten systeem elimineert de noodzaak voor de behandeling van de monsters met behulp van een strikte inperking, zoals BSL-4 voorwaarden7, en de monsters kunnen worden behandeld onder normale omstandigheden van BSL-2. Deze methode inactivatie is compatibel met verschillende nb Extractiesystemen, zoals robots en hand reiniging kits7; echter, deze methoden vereisen laboratoriumapparatuur, zoals robots, centrifuges en elektriciteit, die niet altijd aanwezig in Veldinstellingen of in ziekenhuis isolatie wijken.
In dit verslag beschrijven we een veilige, snelle en vereenvoudigde handmatige nb extractiemethode voor de latere moleculaire detectie van een virus in cellysis/bindende buffer-geïnactiveerd volbloed. De nb-extractiemethode hoeft niet alle apparatuur dan een magneet/magnetische houder. Geen centrifuges, Verwarming blokken, of elektriciteit nodig zijn voor de NA extractie. Vandaar, deze methode is niet afhankelijk van laboratoriumfaciliteiten en kan gemakkelijk worden gebruikt (bijvoorbeeld, in veldhospitalen, in ziekenhuis isolatie wijken, of met lage-broninstellingen) overal. De nb-extractiemethode is snel en eenvoudig en rechtstreeks in elke stroomafwaartse nb proeven, zoals qPCR, RT-qPCR, LAMP of RT-LAMP kan worden gebruikt. Wanneer deze NA-extractiemethode wordt gecombineerd met LAMP en een draagbare batterij-gedreven isothermische instrument, kan een bed diagnose binnen 40 min van de bloedinzameling worden verkregen.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dit verslag beschrijven we een veilige, snelle en eenvoudige handleiding bed nb extractiemethode voor de downstream moleculaire detectie van een virus in cellysis/bindende buffer-geïnactiveerd volbloed. De beschreven nb-extractiemethode werd ontwikkeld om rechtstreeks op volbloed monsters verzameld in vacuüm bloed collectie buizen met de lysis/bindende buffer (Tabel of Materials)7worden uitgevoerd. Deze specifieke buffer inactiveert EBOV7 en is de krit…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Susanne Lopes Rasmussen en Solvej Kolbjørn Jensen voor hun technische bijstand en voor de behandeling van de klinische monsters. Dit project is onderdeel van het EbolaMoDRAD consortium, dat financiering heeft ontvangen van de innovatieve geneeskunde initiatief 2 gemeenschappelijke onderneming onder grant overeenkomst N ° 115843. Deze gemeenschappelijkeonderneming krijgt ondersteuning van de Europese Unie Horizon 2020 onderzoeks- en innovatie-programma en EFPIA.
Materials
| Vacutainer K2 EDTA tubes (4 mL) | Becton Dickinson | 368861 | |
| Plus Blood Collection | Becton Dickinson | 362725 | |
| 23G x 1 needle | Becton Dickinson | 300800 | |
| LUER LOK syringe (3 mL) | Becton Dickinson | 309658 | |
| Butterfly needle with small-bore extension tubing | Jørgen Kruuse A/S | 121714 | |
| 1% Virkon | Nomeco A/S | 849265 | |
| MagNA Pure LC DNA Isolation Kit I – Lysis/Binding Buffer – Refill | Roche Diagnostics A/S | 03246752001 | |
| MagNA Pure LC Total Nucleic Acid Isolation Kit | Roche Diagnostics A/S | 3038505001 | |
| Nunc™ Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes (1,8 mL) | Thermo Fisher Scientific | 375418 | |
| Nunc™ Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes (3,6 mL) | Thermo Fisher Scientific | 379189 | |
| Nunc™ Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes (4,5 mL) | Thermo Fisher Scientific | 379146 | |
| DynaMag™-5 Magnet | Thermo Fisher Scientific | 12303D | |
| Transfer pipette (3.5 mL) | Sarstedt | 86.1171.010 | |
| Thermo Scientific™ Samco™ Fine Tip Transfer Pipettes (1.5 mL) | Thermo Fisher Scientific | 231 | |
| Thermo Scientific™ Nunc™ 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 339652 |
References
- Lee, D., Shin, Y., Chung, S., Hwang, K. S., Yoon, D. S., Lee, J. H. Simple and Highly Sensitive Molecular Diagnosis of Zika Virus by Lateral Flow Assays. Analytical Chemistry. 88, 12272-12278 (2016).
- Benzine, J. W., Brown, K. M., et al. Molecular Diagnostic Field Test for Point-of-Care Detection of Ebola Virus Directly from Blood. Journal of Infectious Diseases. 214 (Suppl 3), S234-S242 (2016).
- Faye, O., Faye, O., et al. Development and deployment of a rapid recombinase polymerase amplification Ebola virus detection assay in Guinea in 2015. Euro Surveillance. 20 (44), 10-18 (2015).
- Yang, M., Ke, Y., et al. Development and Evaluation of a Rapid and Sensitive EBOV-RPA Test for Rapid Diagnosis of Ebola Virus Disease. Scientific Reports. 6, (2016).
- Smither, S. J., Weller, S. A., et al. Buffer AVL alone does not inactivate Ebola virus in a representative clinical sample type. Journal of Clinical Microbiology. 53 (10), 3148-3154 (2015).
- Byrnes, S., Fan, A., et al. A Portable, Pressure Driven, Room Temperature Nucleic Acid Extraction and Storage System for Point of Care Molecular Diagnostics. Analytical Methods. 5 (13), 3177-3184 (2013).
- Rosenstierne, M. W., Karlberg, H., et al. Rapid bedside inactivation of Ebola virus for safe nucleic acid tests. Journal of Clinical Microbiology. 54 (10), 2521-2529 (2016).
- Vinner, L., Fomsgaard, A. Inactivation of orthopoxvirus for diagnostic PCR analysis. Journal of Virological Methods. 146, 401-404 (2007).
- Schmitz, H., Köhler, B., et al. Monitoring of clinical and laboratory data in two cases of imported Lassa fever. Microbes and Infection. 4 (1), 43-50 (2002).
- De La Vega, M. A., Caleo, G., et al. Ebola viral load at diagnosis associates with patient outcome and outbreak evolution. Journal of Clinical Investigation. 125 (12), 4421-4428 (2015).
- Hasanoglu, I., Guner, R., et al. Dynamics of viral load in Crimean Congo hemorrhagic fever. Journal of Medical Virology. 90 (4), 639-643 (2017).
- Biava, M., Colavita, F., et al. Evaluation of a rapid and sensitive RT-qPCR assay for the detection of Ebola Virus. Journal of Virological Methods. 252, 70-74 (2018).
- Fernández-Carballo, B. L., McBeth, C., et al. Continuous-flow, microfluidic, qRT-PCR system for RNA virus detection. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 410 (1), 33-43 (2017).
- Weller, S. A., Bailey, D., et al. Evaluation of the Biofire FilmArray Biothreat E-test (v2.5) for rapid identification of Ebola virus disease in heat-treated blood samples obtained in Sierra Leone and United Kingdom. Journal of Clinical Microbiology. 54 (1), 114-119 (2015).
- Semper, A. E., Broadhurst, M. J., et al. Performance of the GeneXpert Ebola Assay for Diagnosis of Ebola Virus Disease in Sierra Leone: A Field Evaluation Study. PLoS Medicine. 13 (3), e1001980 (2016).
- Biocartis. . Instructions for Use: Idylla TM Ebola Virus Triage Test. , (2016).
- MPLC. . Total Nucleic Acid Isolation Kit. Safety data sheet version 1.7. , (2015).
