חילוץ מהיר, בטוח, ופשוט ידנית המיטה חומצת גרעין איתור וירוס בדגימות דם מלא
Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול להפקת חומצות גרעין וירוס מהירה מהדם כל וירוס-לא פעיל. החילוץ מתבצע ישירות על צינורות איסוף דם ואינו דורש שום ציוד או חשמל. השיטה אינה תלויה למתקני המעבדה וניתן להשתמש בהם בכל מקום (למשל, בבתי-חולים שדה).
Abstract
האבחון מהיר של זיהום חיוני עבור ניהול התפרצות, הסיכון הבלימה, הטיפול בחולה. אנחנו בעבר הראו שיטה מהירה המיטה איון של וירוס האבולה במהלך לקיחת דמים לבדיקות בטוח חומצת גרעין (NA) על-ידי הוספת מאגר פירוק מסחריות/איגוד ישירות לתוך צינורות איסוף דם ואקום. באמצעות גישה זו המיטה איון, פיתחנו פשוטה, מהירה ובטוחה המיטה נה החילוץ שיטת הגילוי עוקבות של וירוס בדם כל פירוק/איגוד להשבית-מאגר. החילוץ נה מתבצע ישירות על צינורות איסוף דם, דורש ציוד או חשמל.
לאחר הדם נאסף לתוך המאגר פירוק/איגוד, התוכן מעורבבים. בהטלת הצינורית ביד, ולא התערובת מודגרת למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. חלקיקים מגנטיים זכוכית (MGPs) מתווספים הצינור, התוכן ומערבבים על ידי flipping הצינור אוסף בעבודת יד. MGPs ואז נאספים בצד הצינור איסוף הדם באמצעות מחזיק מגנטי או מגנט, גומייה. MGPs נשטפים שלוש פעמים, אחרי התוספת של מאגר • תנאי ישירות לתוך הצינור אוסף, NAs מוכנות לבדיקות נה, כגון qPCR או לולאה איזותרמי הגברה (מנורה), ללא הסרת MGPs של התגובה. שיטת החילוץ נה אינה תלויה כלשהו למתקני המעבדה, ניתן בקלות להשתמש בכל מקום (למשל, בבתי חולים שדה ובתי החולים בידוד במחלקות). כאשר שיטה זו החילוץ נה משולב עם המנורה, מכשיר נייד, ניתן לקבל אבחון בתוך 40 דקות של אוסף דם.
Introduction
במצבים התפרצות וירוס, כאשר בחולים מרותקים במחלקות בידוד חולים או כאשר נדרשת אבחנה מהירה, מדויקת, פשוטה ובטוחה בשלב של טיפול מולקולרית אבחון הכרחי הסגר לחולה הטיפול ואת הסיכון. שני האחרונים ויראלי התפרצויות, של וירוס האבולה (EBOV) במערב אפריקה (2013) והוירוס Zika בדרום אמריקה (2015), הגדילו את עניין משופרת בשלב של טיפול מולקולרית בדיקות אבחון, כגון שעתוק במהופך בתיווך לולאה איזותרמי הגברה (RT-המנורה)1,2 ו- recombinase פולימראז הגברה (RPA)3,4. RT-המנורה והן RPA הן בדיקות מולקולריות מהירה, רגיש, ספציפי שניתן לבצע על ההכנות דוגמה מפושטת. . הוירוס Zika RT-המנורה יש כבר בשילוב עם וזמינותו זרימה לרוחב (LFA), אשר יכול לזהות וירוס Zika בדגימות דם מלא שאינם מטוהרים בתוך 30 דקות1; עם זאת, עבור EBOV, אשר מסווגים חיידק קבוצה 4 סיכון והוא מדבק מאוד, הדגימות צריך להתנהל תחת אבטחה ברמה 4 תנאים (BSL-4) ו לא פעיל לפני כל הפרוצדורות האבחוניות בטוח שניתן לבצע.
שיטות איון פשוטה EBOV, כגון התוספת של פירוק מאגרי מדגם2,3,4,5, שימשו במהלך ההתפרצות; עם זאת, שיטות אלה דורשים טיפול בתנאים BSL-4 עם ציוד מעבדה, כגון ארונות אבטחה BSL-3, צנטריפוגות, חימום בלוקים, פיפטות, לכל הפחות. ציוד זה קיים בדרך כלל לא במחלקות בידוד או בבתי-חולים שדה. כדי להתגבר על האתגר הזה, נעשים ניסיונות לבצע אבחון מזוודות3ולאחר מספר מכשירים ניידים, מכונות כבר מפותחת [למשל, מכשיר נייד להפקת חומצות גרעין (NA)]6. עם זאת, עדיין דוגמאות EBOV-חיובית עליך ניתן להשבית התקנים אלה שניתן יהיה להשתמש בהם.
אנחנו דיווחו בעבר כי שיטה איון וירוס המיטה מהירה עבור EBOV7, וירוס Vaccinia, וירוס אבעבועות הפרות8 על ידי תוספת של מאגר פירוק מסחריות/איגוד אל צינורות איסוף דם ואקום רגיל, המאפשר הישיר העברה של דם מן המטופל לתוך מאגר השתקה של כרומוזום7. איון זה ישירה ומיידית בתוך מערכת סגורה מבטלת את הצורך טיפול בדגימות משתמש בכל בלימה קפדני, כגון תנאי BSL-47, הדגימות ניתן לטפל בתנאים רגילים BSL-2. שיטה זו איון היא תואמים מספר מערכות חילוץ נה, כמו רובוטים ערכות טיהור יד7; עם זאת, שיטות אלה דורשים ציוד מעבדה, כגון רובוטים, בדיקות חשמל, אשר אינם תמיד נוכח הגדרות שדה או בתוך בית החולים בידוד במחלקות.
בדו ח זה, אנו מתארים פשוטה, מהירה ובטוחה ידנית נה החילוץ שיטת זיהוי מולקולרי עוקבות של נגיף בדם כל פירוק/איגוד להשבית-מאגר. שיטת החילוץ נה אינו דורש שום ציוד שאינו בעל מגנט/מגנטי. אין צנטריפוגות, חימום בלוקים או חשמל יש צורך החילוץ נה. לפיכך, שיטה זו אינה תלויה למתקני המעבדה, ניתן בקלות להשתמש בכל מקום (למשל, בבתי-חולים שדה, במחלקות בידוד בבית החולים, או עם הגדרות משאבים נמוכה). שיטת החילוץ NA היא מהירה ופשוטה, והוא יכול לשמש ישירות בבדיקות נה במורד הזרם, כגון qPCR, RT-qPCR, מנורה או RT-המנורה. כאשר שיטה זו החילוץ נה משולב עם המנורה, מונחה הסוללה איזותרמי מכשיר נייד, ניתן לקבל אבחנה המיטה בתוך 40 דקות של אוסף דם.
Protocol
Representative Results
Discussion
בדו ח זה, אנו מתארים פשוטה, מהירה ובטוחה ידנית המיטה נה החילוץ שיטת זיהוי מולקולרי במורד הזרם של נגיף בדם כל פירוק/איגוד להשבית-מאגר. שיטת החילוץ נה שתואר פותחה כדי להתבצע ישירות על דגימות דם נאסף הדם ואקום צינורות אוסף המכיל את פירוק/איגוד מאגר (טבלה של חומרים)7. מאגר ס…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים Susanne מרגריטה לופס רסמוסן וג’נסן Kolbjørn Solvej לסיוע טכני שלהם ועל לטיפול הדגימות קליניים. פרויקט זה הוא חלק. האיחוד EbolaMoDRAD, אשר קיבלה מימון חדשני רפואה היוזמה 2 Joint Undertaking תחת גרנט הסכם N ° 115843. זה Joint Undertaking מקבל תמיכה המחקר של האיחוד האירופי אופק 2020, ותוכנית חדשנות EFPIA.
Materials
| Vacutainer K2 EDTA tubes (4 mL) | Becton Dickinson | 368861 | |
| Plus Blood Collection | Becton Dickinson | 362725 | |
| 23G x 1 needle | Becton Dickinson | 300800 | |
| LUER LOK syringe (3 mL) | Becton Dickinson | 309658 | |
| Butterfly needle with small-bore extension tubing | Jørgen Kruuse A/S | 121714 | |
| 1% Virkon | Nomeco A/S | 849265 | |
| MagNA Pure LC DNA Isolation Kit I – Lysis/Binding Buffer – Refill | Roche Diagnostics A/S | 03246752001 | |
| MagNA Pure LC Total Nucleic Acid Isolation Kit | Roche Diagnostics A/S | 3038505001 | |
| Nunc™ Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes (1,8 mL) | Thermo Fisher Scientific | 375418 | |
| Nunc™ Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes (3,6 mL) | Thermo Fisher Scientific | 379189 | |
| Nunc™ Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes (4,5 mL) | Thermo Fisher Scientific | 379146 | |
| DynaMag™-5 Magnet | Thermo Fisher Scientific | 12303D | |
| Transfer pipette (3.5 mL) | Sarstedt | 86.1171.010 | |
| Thermo Scientific™ Samco™ Fine Tip Transfer Pipettes (1.5 mL) | Thermo Fisher Scientific | 231 | |
| Thermo Scientific™ Nunc™ 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 339652 |
References
- Lee, D., Shin, Y., Chung, S., Hwang, K. S., Yoon, D. S., Lee, J. H. Simple and Highly Sensitive Molecular Diagnosis of Zika Virus by Lateral Flow Assays. Analytical Chemistry. 88, 12272-12278 (2016).
- Benzine, J. W., Brown, K. M., et al. Molecular Diagnostic Field Test for Point-of-Care Detection of Ebola Virus Directly from Blood. Journal of Infectious Diseases. 214 (Suppl 3), S234-S242 (2016).
- Faye, O., Faye, O., et al. Development and deployment of a rapid recombinase polymerase amplification Ebola virus detection assay in Guinea in 2015. Euro Surveillance. 20 (44), 10-18 (2015).
- Yang, M., Ke, Y., et al. Development and Evaluation of a Rapid and Sensitive EBOV-RPA Test for Rapid Diagnosis of Ebola Virus Disease. Scientific Reports. 6, (2016).
- Smither, S. J., Weller, S. A., et al. Buffer AVL alone does not inactivate Ebola virus in a representative clinical sample type. Journal of Clinical Microbiology. 53 (10), 3148-3154 (2015).
- Byrnes, S., Fan, A., et al. A Portable, Pressure Driven, Room Temperature Nucleic Acid Extraction and Storage System for Point of Care Molecular Diagnostics. Analytical Methods. 5 (13), 3177-3184 (2013).
- Rosenstierne, M. W., Karlberg, H., et al. Rapid bedside inactivation of Ebola virus for safe nucleic acid tests. Journal of Clinical Microbiology. 54 (10), 2521-2529 (2016).
- Vinner, L., Fomsgaard, A. Inactivation of orthopoxvirus for diagnostic PCR analysis. Journal of Virological Methods. 146, 401-404 (2007).
- Schmitz, H., Köhler, B., et al. Monitoring of clinical and laboratory data in two cases of imported Lassa fever. Microbes and Infection. 4 (1), 43-50 (2002).
- De La Vega, M. A., Caleo, G., et al. Ebola viral load at diagnosis associates with patient outcome and outbreak evolution. Journal of Clinical Investigation. 125 (12), 4421-4428 (2015).
- Hasanoglu, I., Guner, R., et al. Dynamics of viral load in Crimean Congo hemorrhagic fever. Journal of Medical Virology. 90 (4), 639-643 (2017).
- Biava, M., Colavita, F., et al. Evaluation of a rapid and sensitive RT-qPCR assay for the detection of Ebola Virus. Journal of Virological Methods. 252, 70-74 (2018).
- Fernández-Carballo, B. L., McBeth, C., et al. Continuous-flow, microfluidic, qRT-PCR system for RNA virus detection. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 410 (1), 33-43 (2017).
- Weller, S. A., Bailey, D., et al. Evaluation of the Biofire FilmArray Biothreat E-test (v2.5) for rapid identification of Ebola virus disease in heat-treated blood samples obtained in Sierra Leone and United Kingdom. Journal of Clinical Microbiology. 54 (1), 114-119 (2015).
- Semper, A. E., Broadhurst, M. J., et al. Performance of the GeneXpert Ebola Assay for Diagnosis of Ebola Virus Disease in Sierra Leone: A Field Evaluation Study. PLoS Medicine. 13 (3), e1001980 (2016).
- Biocartis. . Instructions for Use: Idylla TM Ebola Virus Triage Test. , (2016).
- MPLC. . Total Nucleic Acid Isolation Kit. Safety data sheet version 1.7. , (2015).
