Aqui, apresentamos um protocolo para examinar larval zebrafish e cabeção peixinho locomotoras atividades e respostas photomotor (PMR), usando um software de rastreamento automatizado. Quando incorporado em comum os bioensaios de toxicologia, análises destes comportamentos fornecem uma ferramenta de diagnóstico para examinar a bioatividade química. Este protocolo é descrito usando a cafeína, um modelo neurostimulant.
Modelos de peixe e comportamentos são cada vez mais utilizados em ciências biomédicas; no entanto, peixe tem sido objecto de estudos ecológicos, fisiológicos e toxicológicos. Usando automatizado plataformas de controle digital, esforços recentes em Neurofarmacologia estão aproveitando comportamentos locomotor de larvas de peixe para identificar potenciais alvos terapêuticos para pequenas moléculas. Semelhante a esses esforços, pesquisa em ciências ambientais e comparativa farmacologia e toxicologia examinou vários comportamentos dos modelos de peixe como ferramentas de diagnóstico na avaliação hierárquica de contaminantes e monitoramento em tempo real das águas de superfície para ameaças de contaminante. Considerando que o peixe-zebra é um modelo popular peixe larval em ciências biomédicas, vairão cabeção é um modelo comum de larvas de peixes em ecotoxicologia. Infelizmente, as larvas de peixe cabeçudo receberam consideravelmente menos atenção em estudos comportamentais. Aqui, podemos desenvolver e demonstrar um protocolo de perfil comportamental usando cafeína como um modelo neurostimulant. Embora photomotor respostas de peixinhos cabeção ocasionalmente foram afetadas pela cafeína, zebrafish eram marcadamente mais sensível para photomotor e pontos de extremidade locomotoras, que respondeu em níveis ambientalmente relevantes. Futuros estudos são necessários para entender as diferenças de sensibilidade comportamental comparativo entre peixe com idade e tempo de dia e para determinar se semelhantes efeitos comportamentais que ocorrem na natureza e ser indicativo de resultados adversos no indivíduo ou níveis de população da organização biológica.
Embora modelos de peixe são cada vez mais utilizados para estudos biomédicos, peixe têm sido empregada rotineiramente para estudos de ecologia e fisiologia, para examinar a contaminação das águas de superfície e entender os limiares toxicológicos dos produtos químicos. Tais esforços são importantes porque a contaminação química pode prejudicar os ecossistemas aquáticos e comprometer a qualidade do abastecimento de água de fonte1,2. A maioria dos produtos químicos no comércio, no entanto, falta até mesmo de informação de toxicologia básica3.
Ensaios de modelo animal tradicionalmente utilizados em testes de toxicidade regulamentar são recurso intensivo e não pode fornecer a alta taxa de transferência, triagem de camada início necessária para toxicidade testes no século XXI4. Posteriormente, há um crescente impulso para adotar e utilizar modelos em vitro que podem mais rapidamente e eficientemente tela compostos por atividades biológicas3,5. Embora modelos de célula com base apresentam muitas oportunidades, eles muitas vezes faltam a complexidade biológica e, portanto, não conta para muitos processos importantes de todo organismo, incluindo metabolismo6.
O peixe-zebra é um modelo comum de animal biomédico que está ganhando popularidade como um modelo alternativo em Toxicologia aquática e Ecotoxicologia7,8. Dado seu tamanho pequeno, rápido desenvolvimento e alta fecundidade, modelos de peixes podem ser usados para produtos químicos para a bioatividade e toxicidade na escala todo organismo9de tela rapidamente e eficientemente. Com o auxílio do software de rastreamento automatizado, larval zebrafish comportamentos fornecem utilitário de diagnóstico avançado em triagem de contaminantes para toxicidade10,11. Estudos nas ciências farmacêuticas têm demonstrado que a locomoção pontos de extremidade são informativos dos mecanismos químicos de ação, podem ser usada para comportamentos de fenótipo e então tentativamente podem identificar subcellular alvos para novas moléculas12, 13. Considerando o zebrafish é um modelo popular peixe larval em ciências biomédicas, vairão cabeção é um modelo comum, ecologicamente importante peixe que é utilizado para estudos de Ecotoxicologia e durante em perspectiva (por exemplo, novas avaliações química) e avaliações ambientais de retrospectiva (por exemplo, ambiente água de superfície ou acompanhamento de descarga de efluentes de águas residuais). Infelizmente, respostas comportamentais de peixinhos cabeção larval receberam marcadamente menos atenção do que o peixe-zebra. Nossa pesquisa em andamento com dois modelos comuns de larvas de peixes, o zebrafish e fathead minnow, sugere que larval peixes nadando padrões aparecem exclusivos para modos antecipados ou mecanismos de ação para diversos produtos químicos. Assim, pontos de extremidade comportamentais fornecem o potencial rapidamente e com sensibilidade examinar produtos químicos para a toxicidade e identificar alvos subcellular para industriais químicos e outros contaminantes, particularmente durante avaliações de nível inicial.
Aqui, nós relatamos um protocolo para análise de perfis de resposta comportamental em peixes larvas. Nós demonstramos esses métodos usando a cafeína, um modelo neurostimulant e um contaminante comum aquático que é introduzido aos sistemas aquáticos através de descarga de tratamentos águas residuais após o consumo de alimentos, bebidas, e produtos farmacêuticos formulados com cafeína14. Nós examinamos as respostas comportamentais à cafeína em ambos larval minnow zebrafish e cabeção, incluindo-se a uma mudança súbita na condição de iluminação, que é muitas vezes referida como uma resposta de photomotor (PMR) durante estudos farmacêuticos com embrionário e larvar zebrafish13,15. Identificamo-nos ainda mais os efeitos da cafeína através de vários pontos de extremidade locomotoras para desenvolver perfis químicos de resposta para cada modelo de peixe. Níveis de tratamento de cafeína utilizados neste estudo representam o centiles superior de distribuições de exposição, com base em valores ambientais medidos de cafeína16. Nós também incluímos tratamentos aferidos para larvas de peixes LC50 valores e o valor terapêutico do perigo (THV), uma concentração farmacêutica na água que é antecipada para resultar em níveis plasmáticos em peixe consistente com uma dose terapêutica de plasma humano.
Ao selecionar os níveis de tratamento químico para estudos de toxicologia comportamental, vários fatores devem ser considerados. Níveis de tratamento de cafeína no presente estudo foram selecionados com base em valores superiores ao percentil para cenários de exposição ambiental prevista de águas residuais efluentes16. Quando possível, selecionamos rotineiramente níveis de tratamento para estudos de Toxicologia aquática utilizando avaliações probabilísticas exposição de observações ambientais19,20,21. Um THV, que é calculável para medicamentos, também foi incluída como um nível de tratamento no presente estudo. THV valores (EQ. 1)22,23 são definidos como as concentrações de água previsto levando a doses terapêuticas humanas (Cmax) de produtos farmacêuticos em peixes23, são inspirados de plasma inicial esforços24de modelagem e são calculado com base na química do sangue: água particionamento coeficientes (EQ. 2)25.
THV = Cmáx / log PBW (EQ. 1)
log PBW = log [(100,73. log Kow · 0.16) + 0,84] (EQ. 2)
Aqui, selecionamos também níveis subletais de tratamento em relação ao zebrafish e fathead minnow LC50 valores. Consideramos esta abordagem um procedimento de avaliação comparativa útil para respostas comportamentais, particularmente quando comparando os limiares de comportamentos específicos, com um modelo de peixe através de vários produtos químicos. Facilita ainda mais os cálculos de aguda para rácios crônicos, que podem ser útil para o diagnóstico em Toxicologia aquática para avaliações e estudos mecanicistas. Foram obtidos valores de CL50 bioensaios de toxicidade preliminar, seguindo as orientações padronizadas dadas no passo 2.1.
Neste protocolo, empregamos comuns projetos experimentais e técnicas estatísticas recomendado pela US EPA e OECD métodos padronizados para estudos de toxicologia com modelos de peixe. Embora nós relatamos p valores (EG., < 0,01, < 0.05, < 0,10), diferenças significativas (α = 0,10) em atividade, níveis são identificados entre os tratamentos, usando a análise de variância (ANOVA) se normalidade e equivalência de suposições de variância forem atendidas. Testes post hoc de Dunnett ou de Tukey HSD são realizados para identificar as diferenças de nível de tratamento. Nós selecionamos este alfa (α = 0,10) valor para reduzir erros de tipo II, particularmente para os primeiros ensaios de camada e quando uma compreensão do tamanho do efeito biologicamente importante é limitada para os pontos de extremidade comportamentais pouco estudados e de organismos modelo26, em vez de empregando os procedimentos mais comuns em ciências biomédicas para comparações múltiplas (por exemplo., correção de Bonferroni para dados de RNA-Seq)27. Futuros estudos são necessários para compreender a variabilidade dessas respostas comportamentais e potencialmente modificar desenhos experimentais (por exemplo, aumento de replicação) em conformidade.
Uma série de fatores pode influenciar o comportamento dos peixes larvas, além de exposição a substâncias químicas. Por exemplo, hora do dia, idade, tamanho bem, temperatura, condições de iluminação e volume de solução de exposição em cada bem representam importantes considerações11,30. Por estas razões, devem ser tomadas precauções para minimizar os efeitos de fatores externos que podem influenciar o comportamento locomotor do peixe larval durante a experimentação. Observações comportamentais devem ser realizadas em janelas de tempo estreita (3 a 4 h) e em períodos de tempo em tempo dos efeitos de dia deverão ter influência mínima sobre comportamento locomotor larval11. Além disso, peixes larvas devem ser mantidos a uma temperatura consistente (28 ± 1 ° C para zebrafish) e 24 ± 1 ° C para FHM e por um ciclo claro/escuro definido nas incubadoras com temperatura controlada durante todo o período de exposição. Além disso, a temperatura do laboratório onde os comportamentos são registrados deve ser mantida para condições de aproximar as condições experimentais para evitar influências de temperatura em comportamentos. Além disso, poços usados durante observações comportamentais devem ser mantidos em um volume consistente para cada peixe individual.
Embrionário e larvar zebrafish que PMRs foram usados anteriormente em ciências biomédicas para identificar alvos terapêuticos para romance compostos,12,13. Este protocolo expande pesquisa comportamental anterior com zebrafish utilizando 38 pontos de extremidade para investigar a bioatividade química dos contaminantes ambientais. Embora a cafeína é um contaminante comum aquático com um mecanismo compreendido de ação (MoA), muitos compostos no comércio faltam dados importantes mecanicistas. Portanto, este protocolo pode ser empregado para ganhar a introspecção de MoAs para compostos faltando dados de toxicidade, incluindo produtos químicos comerciais39. Além disso, o protocolo fornece métodos para dois dos modelos de peixes mais comumente usados. Conforme observado anteriormente, considerando o zebrafish é um modelo biomédico peixe comum que está se tornando cada vez mais popular em ecotoxicologia, o fathead minnow é comumente usado como um modelo ecológico para aplicações de avaliação ambiental, mas recebeu comparativamente menos atenção em estudos comportamentais com sistemas automatizados, em comparação com o peixe-zebra. Embora não ainda não há nenhum métodos padronizados regulamentares para estudos de toxicologia comportamental de peixes, este protocolo fornece uma abordagem para suportar os esforços futuros.
Cafeína suscitou respostas comportamentais em cada um dos modelos de peixes em níveis que foram detectados no ambiente aquático16. Rodriguez-Gil et al . 2018 desenvolvido distribuições de exposição ambiental global em sistemas aquáticos com base nos valores medidos de cafeína16. Especificamente, 95% das concentrações efluentes de águas residuais previsto cairia abaixo as LOECs para os pontos de extremidade comportamentais mais sensíveis de zebrafish e fathead minnow no presente estudo (tabela 2). Embora vários efeitos comportamentais de cafeína foram observados no zebrafish (particularmente em condições escuras) em níveis ambientalmente relevantes, não está claro se essas modificações comportamentais podem ocorrer nas populações naturais de peixes ou resultar em ecologicamente importantes resultados adversos. Embora útil para fins de seleção sensível, diagnóstico, limiares comportamental de larvas de peixes podem não ser representativa de outras fases da história de vida ou de peixe em populações naturais. Uma pesquisa mais adicional é garantida para determinar se semelhante limiares de resposta comportamental que ocorre na natureza e ser indicativo de resultados adversos nos níveis de organização biológica indivíduo ou população.
The authors have nothing to disclose.
Suporte para este estudo foi fornecido pelo US National Science Foundation (projeto #:-1339637) com o apoio adicional da Agência de proteção ambiental dos Estados Unidos. Agradecemos o Dr. Jone Corrales, Dr. Lauren Kristofco, Gavin Saari, Samuel Haddad, Bekah Burket e Bridgett Hill para suporte geral do laboratório.
ViewPoint Zebrabox | ViewPoint | ZebraLab and ZebraLab platform for automated behavioral observations | |
Caffeine | Sigma-Aldrich | C0750-100G | Study chemical |
Incubator | VWR | 9110589 | Maintains light/dark cycle and temperature for fathead minnow experiments |
Incubator | Thermo Fisher Scientific | 35824-636 | Maintains light/dark cycle and temperature for zebrafish experiments |
100 ml glass beakers | VWR | 89000-200 | Zebrafish exposure chambers |
500 ml glass beakers | Pyrex | EW-34502-03 | Fathead minnow exposure chambers |
5000 µl auto-pipette | Eppendorf | Research 5000 | Used to fill individual wells in well plates |
Transfer Pippettes | VWR | 414-004-004 | Used to transfer study organisms |
48-well plates | Fisher Scientific | 08-772-52 | Larval zebrafish behavioral recording chambers |
24-well plates | VWR | 10062-896 | Larval fathead minnow behavioral recording chambers |
Calcium sulfate dihydrate | Sigma-Aldrich | C3771 | For reconstituted hard water |
Magnesium Sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | For reconstituted hard water |
Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | For reconstituted hard water |
Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | For reconstituted hard water |
z-mod recirculating system | Marine Biotech Systems | Recirculating system to maintian zebrafish cultures | |
Statistical analysis software | Sigma Plot | Version 13.0 | Used to analyze beahvioral data and produce figures |
Statistical analysis software | Graphpad Prism | Prism 5 | Used to produce figures |
Autosampler/quaternary pumping system | Agilent Technologies | Infinity 1260 model | Analytical verification of caffeine treatment levels |
Jet stream thermal gradient electrospray ionization source | Agilent Technologies | Analytical verification of caffeine treatment levels | |
Triple quadrupole mass analyzer | Agilent Technologies | Model 6420 | Analytical verification of caffeine treatment levels |
10 cm × 2.1 mm Poroshell 120 SB-AQ column (120Å, 2.7) | Agilent Technologies | 685775-914T | Caffiene chromatography |
MassHunter Optimizer Software | Agilent Technologies | Determine the ionization mode, monitored transitions, and instrumental parameters for caffeine/caffeine-d9 and paraxanthine/paraxanthine-d6 |