在这里, 我们提出了一个协议, 以检查斑马鱼和傻瓜鱼的运动活动和 photomotor 反应 (PMR) 使用自动跟踪软件。在共同的毒理学生物鉴定中, 对这些行为的分析提供了一种检查化学活性的诊断工具。这个协议是用咖啡因, 一个模型 neurostimulant 描述的。
鱼类模型和行为越来越多地应用于生物医学科学;然而, 鱼类长期以来一直是生态、生理和毒理学研究的主题。使用自动数字跟踪平台, 最近在神经药理学的努力利用幼虫鱼的运动行为, 以确定潜在的治疗目标的新的小分子。与这些努力类似, 环境科学和比较药理学和毒理学的研究正在审查鱼类模型的各种行为, 作为对污染物进行分层评估的诊断工具和对地表水的实时监测, 以污染威胁。斑马鱼是生物医学科学中流行的幼体鱼类模型, 而傻瓜鱼是生态中常见的幼虫鱼类模型。不幸的是, 傻瓜小鱼幼虫在行为学研究中受到的关注较少。在这里, 我们开发并演示了一种使用咖啡因作为模型 neurostimulant 的行为配置文件协议。虽然傻瓜鱼的 photomotor 反应偶尔受到咖啡因的影响, 但斑马鱼对 photomotor 和运动终点的敏感度明显更高, 在环境相关的水平上反应。今后的研究需要了解鱼类与日龄和时间的比较行为敏感性差异, 并确定类似的行为效应是否会发生在自然界中, 并表明在个人或生物组织的人口水平。
虽然鱼类模型越来越多地用于生物医学研究, 但鱼类经常被用于生态学和生理学研究, 检查地表水的污染, 并了解化学品的毒理学门槛。这种努力很重要, 因为化学污染会损害水生生态系统, 危害水源水供应的质量1,2。然而, 商业中的大多数化学品甚至缺乏基本的毒物学信息3。
传统上用于管制毒性试验的动物模型化验是资源密集型的, 不能提供4第二十一世纪毒性试验所需的高通量、早期筛查。随后, 采用和利用体外模型的动力越来越大, 可以更迅速、更有效地筛选生物活动的化合物3、5。虽然基于细胞的模型提供了许多机会, 但它们往往缺乏生物复杂性, 因此不能解释许多重要的整个有机体过程, 包括新陈代谢6。
斑马鱼是一种常见的生物医学动物模型, 作为一种替代模式在水生毒物学和生态7,8获得普及。由于鱼类模型体积小、发育迅速、繁殖力高, 可用于快速高效地筛查化学物质在整个生物体9级的生物活性和毒性。在自动跟踪软件的帮助下, 斑马鱼的幼虫行为提供了增强的诊断效用, 用于筛选毒性10,11的污染物。药物学研究表明, 运动端点是化学作用机制的信息, 可用于表型行为, 然后可以初步确定新分子12的亚细胞靶点, 13。斑马鱼是生物医学科学中流行的幼虫鱼模型, 而傻瓜鱼是一种常见的生态重要鱼类模型, 用于生态研究和前瞻性 (例如, 新的化学评价) 和回顾 (例如,环境地表水或废水排放监测) 环境评估。不幸的是, 幼虫傻瓜小鱼的行为反应受到的关注明显少于斑马鱼。我们正在进行的研究与两种常见的幼虫鱼模型, 斑马鱼和傻瓜鲤鱼, 表明幼虫鱼类游泳模式似乎独特的预期模式或行动机制的各种化学品。因此, 行为端点提供了迅速和敏感地检查化学品毒性的潜力, 并确定工业化学品和其他污染物的亚细胞目标, 特别是在早期评估期间。
在这里, 我们报告了一个检查幼虫鱼行为反应剖面的协议。我们用咖啡因、模型 neurostimulant 和一种常见的水生污染物来演示这些方法, 通过污水处理厂排出的食物、饮料和用咖啡因配制的药物14。我们检查对斑马鱼和傻瓜鱼的咖啡因的行为反应, 包括在光照条件的突然变化, 这通常被称为 photomotor 反应 (PMR) 在药物研究与胚胎和幼虫斑马鱼13,15。我们进一步确定咖啡因对几个运动端点的影响, 为每个鱼类模型开发化学反应剖面。本研究中使用的咖啡因治疗水平代表了基于咖啡因16测量环境值的暴露分布上 centiles。我们还包括基准的治疗幼虫的鱼 LC50值, 和治疗危险值 (THV), 在水中的药物浓度预期会导致在鱼血浆水平与人类治疗血浆剂量一致。
在为行为毒理学研究选择化学治疗水平时, 必须考虑几个因素。本研究中的咖啡因治疗水平是根据16污水排放预测环境暴露情况的上 centile 值选择的。在可能的情况下, 我们通常会使用环境观测19、20、21的概率暴露评估来选择水生毒物学研究的治疗水平。一种可计算为药物的 THV 也被作为治疗水平纳入本研究。THV 值 (Eq 1)22,23被定义为预测的水浓度导致人类治疗剂量 (Cmax) 的药物在鱼23, 是灵感来自最初的等离子建模努力24, 并根据血液计算: 水化学分配系数 (Eq 2)25。
THV = C最大/对数 P (Eq 1)
日志 P = 日志 [(100.73. 日志九· 0.16) + 0.84] (Eq 2)
在这里, 我们也选择致死治疗水平相对于斑马鱼和傻瓜鲤鱼 LC50 价值。我们认为这一方法是一个有用的基准程序的行为反应, 特别是当比较特定行为的阈值与鱼类模型跨多个化学品。它进一步促进了对急性和慢性比值的计算, 这对于机械研究和评估的水生毒物学诊断有用。LC50 值是根据步骤2.1 中给出的标准准则从初步毒性生物鉴定中获得的。
在本议定书中, 我们采用了美国 EPA 和经合组织为鱼类模型进行毒理学研究的标准化方法所推荐的通用实验设计和统计技术。虽然我们报告p值 (e., < 0.01, < 0.05, < 0.10), 在活动水平上的显著差异 (α = 0.10) 在使用方差分析的方法中, 如果方差假设的常态和等价性被确定得到满足。Dunnett 或 Tukey 的 HSD 后进行专项测试, 以确定治疗水平的差异。我们选择这个 alpha (α = 0.10) 值, 以减少第二类错误, 特别是早期的层次分析, 当了解生物重要的影响大小是有限的理解行为终结点和模型有机体26, 而不是在生物医学科学中使用的程序比较常见, 用于多种比较 (例如, RNA 序列数据的 Bonferroni 校正)27。 未来的研究需要了解这些行为反应的变异性, 并有可能修改实验设计 (例如, 增加复制)。
除了化学暴露外, 还有许多因素会影响幼体的行为。例如, 在每个井中, 每天的时间、年龄、大小、温度、光照条件和曝光解决方案的体积都代表重要的考虑因素11、30。因此, 应采取预防措施, 尽量减少影响幼虫在试验过程中的运动行为的外在因素的影响。行为观察应在狭窄的时间窗口 (3 到4小时) 和跨越时间段, 当一天的影响预计对幼虫运动行为的影响最小11。此外, 幼虫鱼应保持在一个一致的温度 (28, 1 °c 为斑马鱼和 24, 1 °c 为男人) 和在一个定义的光/暗循环的温度控制孵化器在整个暴露期间。此外, 记录行为的实验室温度应保持在接近实验条件的条件下, 以避免温度对行为的影响。此外, 在行为观测期间使用的水井应保持在每条鱼的一致体积。
幼虫和胚胎斑马鱼 PMRs 以前曾用于生物医学科学, 以确定潜在的治疗目标的新化合物12,13。该协议扩大了以前的行为研究与斑马鱼通过利用38端点来调查环境污染物的化学生物活性。虽然咖啡因是一种常见的水生污染物, 有一种理解的作用机制, 但许多商业中的化合物缺乏重要的机械数据。因此, 本议定书可用于获得起效模式的化合物缺乏毒性数据, 包括商业化学品39。此外, 该议定书还为两种最常用的鱼类模型提供了方法。如前所述, 斑马鱼是一种常见的生物医学鱼类模型, 在生态越来越受欢迎, 傻瓜鱼通常被用作环境评估应用的生态模型, 但已收到相对于斑马鱼来说, 与自动化系统相比, 对行为研究的关注较少。虽然对鱼类行为毒理学研究尚无规范化的管理方法, 但该议定书提供了一种支持今后努力的方法。
咖啡因引起的行为反应在每一个鱼模型在水平上已经发现在水生环境16。罗德里格斯-吉尔等2018 根据咖啡因测定值16, 在水生系统中开发了全球环境暴露分布。具体地说, 在本研究中, 95% 的预测废水排放浓度将低于 LOECs 斑马鱼和傻瓜鱼最敏感的行为终点 (表 2)。尽管在环境相关的水平上, 斑马鱼 (特别是在黑暗条件下) 观察到咖啡因的几种行为效应, 但目前还不清楚这些行为是否会发生在天然鱼类种群中, 或导致生态上重要的不利结果。虽然对敏感的、诊断性的筛查有用, 但幼虫的行为阈值可能不代表其他生命史阶段或自然种群中的鱼类。还有必要进行进一步的研究, 以确定类似的行为反应阈值是否会发生在自然界中, 并表明生物组织的个体或人口水平的不利结果。
The authors have nothing to disclose.
这项研究的支持是由美国国家科学基金会 (项目 #: CHE-1339637) 提供的, 并得到美国环境保护局的额外支持。我们感谢琼斯博士 Corrales, 劳伦 Kristofco 博士, 加文 Saari, 塞缪尔哈达德, Bekah 伯克特和 Bridgett 希尔的一般实验室支持。
ViewPoint Zebrabox | ViewPoint | ZebraLab and ZebraLab platform for automated behavioral observations | |
Caffeine | Sigma-Aldrich | C0750-100G | Study chemical |
Incubator | VWR | 9110589 | Maintains light/dark cycle and temperature for fathead minnow experiments |
Incubator | Thermo Fisher Scientific | 35824-636 | Maintains light/dark cycle and temperature for zebrafish experiments |
100 ml glass beakers | VWR | 89000-200 | Zebrafish exposure chambers |
500 ml glass beakers | Pyrex | EW-34502-03 | Fathead minnow exposure chambers |
5000 µl auto-pipette | Eppendorf | Research 5000 | Used to fill individual wells in well plates |
Transfer Pippettes | VWR | 414-004-004 | Used to transfer study organisms |
48-well plates | Fisher Scientific | 08-772-52 | Larval zebrafish behavioral recording chambers |
24-well plates | VWR | 10062-896 | Larval fathead minnow behavioral recording chambers |
Calcium sulfate dihydrate | Sigma-Aldrich | C3771 | For reconstituted hard water |
Magnesium Sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | For reconstituted hard water |
Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | For reconstituted hard water |
Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | For reconstituted hard water |
z-mod recirculating system | Marine Biotech Systems | Recirculating system to maintian zebrafish cultures | |
Statistical analysis software | Sigma Plot | Version 13.0 | Used to analyze beahvioral data and produce figures |
Statistical analysis software | Graphpad Prism | Prism 5 | Used to produce figures |
Autosampler/quaternary pumping system | Agilent Technologies | Infinity 1260 model | Analytical verification of caffeine treatment levels |
Jet stream thermal gradient electrospray ionization source | Agilent Technologies | Analytical verification of caffeine treatment levels | |
Triple quadrupole mass analyzer | Agilent Technologies | Model 6420 | Analytical verification of caffeine treatment levels |
10 cm × 2.1 mm Poroshell 120 SB-AQ column (120Å, 2.7) | Agilent Technologies | 685775-914T | Caffiene chromatography |
MassHunter Optimizer Software | Agilent Technologies | Determine the ionization mode, monitored transitions, and instrumental parameters for caffeine/caffeine-d9 and paraxanthine/paraxanthine-d6 |