כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבחון פעילויות זחל דג זברה, פאטהד מינו גינקולוגיות ותגובות photomotor (PMR) באמצעות תוכנת מעקב אוטומטי אנטי. כאשר שולבו במשותף הרעלים bioassays, ניתוחים של התנהגויות אלו מספקים כלי אבחון לבחון אתריים כימי. פרוטוקול זה מתואר באמצעות קפאין, neurostimulant מודל.
מודלים של דגים, התנהגויות משמשים יותר ויותר במדעים הביו-רפואית; עם זאת, דגים כבר מזמן הנושא של מחקרים אקולוגיים, פיזיולוגיים, רעילות. שימוש אוטומטי מעקב דיגיטלי פלטפורמות, מאמצים שנעשו לאחרונה ב- neuropharmacology הם מינוף זחל דגים התנהגויות גינקולוגיות לזהות מטרות טיפוליות אפשריות עבור הרומן מולקולות קטנות. בדומה למאמצים הללו, מחקר מדעי הסביבה, פרמקולוגיה השוואתי, הרעלים הוא בחינת התנהגויות שונות של דגמי דגים כמו כלי אבחון וניטור בזמן אמת של פני המים עבור הערכה בשכבות של מזהמים של איומים מזהם. ואילו דג זברה הוא מודל פופולרי דגים זחל במדעים הביו-רפואית, מינו פטהד הוא מודל דגים הזחל נפוץ ב- ecotoxicology. למרבה הצער, פאטהד מינו הזחלים קיבלו הרבה פחות תשומת לב במחקרים התנהגותיים. כאן, אנו מפתחים להדגים פרוטוקול הפרופיל ההתנהגותי באמצעות קפאין כמו neurostimulant המודל. למרות התגובות photomotor של דגי פטהד הושפעו לעיתים קפאין, דג זברה היו במידה ניכרת יותר רגישים photomotor, הקצה גינקולוגיות, אשר הגיבו ברמות רלוונטי לסביבה. מחקרים עתידיים יש צורך להבין רגישות התנהגותית השוואתי ההבדלים בין דגים עם הגיל, שעת היום, וכדי לקבוע אם תופעות התנהגותיות דומות מתרחשות בטבע אינדיקטיבית תוצאות שליליות של האדם או האוכלוסייה רמות הארגון הביולוגי.
על פי מודלים דגים משמשים יותר ויותר מחקרים ביו, דגים יש כבר באופן שגרתי מועסקים ללימודי אקולוגיה, פיזיולוגיה, לבחון זיהום של פני המים, וכדי להבין את סף רעילות של כימיקלים. מאמצים כאלה הם חשובים כי זיהום כימי יכול לפגום המערכת האקולוגית הימית ולסכן את האיכות של מקור אספקת המים1,2. רוב הכימיקלים בתחום המסחר, עם זאת, חוסר אפילו מידע בסיסי3.
מבחני במודל חיה משמשת גם בדיקות רעילות רגולטוריות משאבים רבים, אין אפשרות לספק את התפוקה גבוהה, בתחילת ההקרנה הרמה הדרושה רעילות בדיקות המאה ה-214. לאחר מכן, יש תנופה גוברת לאמץ ולנצל מודלים במבחנה שיכולים יותר במהירות וביעילות המסך תרכובות פעילות ביולוגית3,5. למרות תא מבוסס מודלים להציג הזדמנויות רבות, הם לעתים קרובות חוסר המורכבות הביולוגית, ובכך להסביר תהליכים מהאורגניזם חשובים רבים, כולל מטבוליזם6.
דג זברה היא דגם נפוץ בעלי חיים ביו זה הוא צובר פופולריות כמו מודל אלטרנטיבי הרעלים הימית,7,ecotoxicology8. בהתחשב שלהם גודל קטן, פיתוח מהיר, פוריות גבוהה, מודלים דגים ניתן למסך במהירות וביעילות כימיקלים אתריים רעילות על סולם מהאורגניזם9. בעזרת תוכנת מעקב אוטומטי, דג זברה זחל התנהגויות מספקים של תוכנית השירות לאבחון משופרת בהקרנת מזהמים רעילות10,11. מחקרים במדעי הרוקחות הראו כי נקודות קצה גינקולוגיות אינפורמטיבי של מנגנוני פעולה כימית, יכול לשמש כדי פנוטיפ התנהגויות, ואז ייתכן באופן לא סופי לזיהוי מטרות subcellular מולקולות הרומן12, 13. ואילו דג זברה הוא מודל פופולרי דגים זחל במדעים הביו-רפואית, מינו פטהד הוא מודל משותף, חשוב מבחינה אקולוגית דגים המשמש ללימודי ecotoxicology, ובמהלך פוטנציאליים (למשל, חדש כימי הערכות) ו רטרוספקטיבה (למשל, טמפרטורת מים עיליים או ניטור שפכים פריקה קולחים) תסקירים. למרבה הצער, תגובות התנהגותיות של דגי פטהד זחל קיבלו במידה ניכרת פחות. תשומת לב מאשר דג זברה. מחקר שוטף שלנו עם שני דגמים דגים הזחל נפוץ, מינו דג זברה, פטהד, מרמז כי הזחל דג שוחה דפוסי להופיע ייחודי למצבי הצפויה או מנגנון פעולה עבור כימיקלים שונים. לפיכך, התנהגותיות נקודות הקצה לספק את הפוטנציאל לבחון במהירות וברגישות כימיקלים רעילות וכדי לזהות מטרות subcellular עבור תעשיה מזהמים כימיים ואחרים, במיוחד במהלך המוקדמות הערכות מהשכבה.
כאן, אנחנו מדווחים על פרוטוקול לבחינת תגובה התנהגותית פרופילים בדגים זחל. נדגים את שיטות אלה באמצעות קפאין, על neurostimulant דגם מזהם הימית נפוצות שהוצגה למערכות מים באמצעות הפרשות של טיפול בשפכים בעקבות צריכת האדם של מזונות, משקאות, ו תרופות ניסח עם קפאין14. אנו בוחנים תגובות התנהגותיות הקפאין אצל שני זחל דג זברה, פאטהד מינו, ובכלל זה שינוי פתאומי במצב תאורה, אשר מתייחסים לרוב כתגובה photomotor (PMR) במהלך לימודי רוקחות עם עובריים, זחל דג זברה13,15. אנו עוד יותר לזהות השפעות הקפאין ברחבי בכמה נקודות קצה גינקולוגיות לפתח תגובה כימית פרופילים עבור כל דגם דגים. רמות הטיפול הקפאין השתמשו במחקר זה מייצגים את centiles העליון של התפלגויות החשיפה בהתבסס על ערכי איכות הסביבה מדודה של קפאין16. אנו גם כוללים טיפולים benchmarked דגים זחל LC50 ערכים, הערך טיפולי הסיכון (THV), ריכוז התרופות במים זה צפוי לגרום פלזמה רמות בדגים בקנה אחד עם מנה לפלסמה אנושית טיפולית.
בעת בחירת טיפול כימי רמות ללימודי טוקסיקולוגיה סביבתית, יש לקחת בחשבון מספר גורמים. קפאין רמות הטיפול במחקר הנוכחי נבחרו על בסיס ערכי centile העליון עבור תרחישים החשיפה הסביבתית החזוי של קולחים שפכים16. במידת האפשר, אנו בוחרים באופן שגרתי לטיפול רמות עבור מחקרים ימיים רעלים באמצעות הערכות חשיפה הסתברותית של תצפיות הסביבה19,20,21. THV, אשר הניתנים לחישוב עבור תרופות, נכללה גם לשלב הטיפול במחקר הנוכחי. THV ערכים (הציוד 1)22,23 מוגדרים ריכוזים מים החזוי שמוביל מינונים טיפולית אנושי (Cmax) של תרופות דגים23, השראה מן הפלסמה הראשונית מידול המאמצים24, הם מחושב בהתבסס על הדם: מים כימי למחיצות המקדמים (הציוד 2)25.
THV = Cמקס / התחבר PBW (הציוד 1)
יומן PBW = יומן [(100.73. יומן קאו · 0.16) + 0.84] (הציוד 2)
כאן, אנחנו גם לבחור רמות הטיפול לא קטלני ביחס מינו דג זברה, פאטהד LC50 ערכים. אנו רואים בגישה זו שגרה בהשוואות שימושי עבור תגובות התנהגותיות, במיוחד בעת השוואת סף של התנהגויות ספציפיות עם דגם דגים על פני כימיקלים מרובים. זה עוד יותר מקלה על חישובים של חריפה על יחסי כרונית, אשר יכול להיות שימושי אבחונית הרעלים ימיים עבור מכניסטית מחקרים והערכות. ערכים LC50, התקבלו bioassays רעילות ראשוני לבצע את ההנחיות מתוקננת בהתחשב בשלב 2.1.
פרוטוקול זה, אנו מעסיקים נפוצות עיצובים מוטוריים, טכניקות סטטיסטיות המומלצת על-ידי אותנו EPA ו- OECD שיטות מתוקננת הרעלים מחקרים במודלים דגים. אבל אנחנו לדווח על פי ערכים (למשל., < 0.01, < 0.05, < 0.10), הבדלים משמעותיים (α = 0.10) בפעילות רמות מזוהים בין טיפולים באמצעות ניתוח השונות (ANOVA) אם נורמליות, שקילות של ההנחות השונות הם נפגשו. של Dunnett או של Tukey HSD הוק לאחר הבדיקות מבוצעות כדי לזהות הבדלים ברמת הטיפול. אנו בוחרים את האלפא (α = 0.10) ערך כדי להפחית סוג II שגיאות, במיוחד עבור מבחני מהשכבה מוקדם, כאשר הבנה של גודל אפקט חשוב מבחינה ביולוגית היא מוגבלת עבור נקודות קצה התנהגותית understudied ודגם אורגניזמים26, במקום העסקת שכיחה יותר בקרב למדעים ביו להשוואות מרובות הליכים (למשל., Bonferroni תיקון עבור נתוני ה-RNA-Seq)27. מחקרים עתידיים יש צורך להבין השתנות של אלה תגובות התנהגותיות, פוטנציאל לשנות עיצובים מוטוריים (למשל, עלייה שכפול) בהתאם.
מספר גורמים יכולים להשפיע על התנהגות של דגים זחל בנוסף לכימיקלים. לדוגמה, זמן של יום, גיל, גודל טוב, טמפרטורה, תנאי תאורה נפח של חשיפה פתרון כל שיקולים חשובים לייצג טוב11,30. מסיבות אלו, אמצעי זהירות יש לנקוט כדי למזער את ההשפעות של גורמים חיצוניים יכול להשפיע על התנהגותו גינקולוגיות של הדג זחל במהלך ניסויים. תצפיות התנהגותיות צריכה להתבצע בחלונות זמן קצר (3-4 שעות), על פני תקופות זמן מתי הזמן של תופעות היום צפויים השפעה מינימלית על התנהגות גינקולוגיות זחל11. בנוסף, דגים זחל צריך להישמר בטמפרטורה אחידה (28 ± 1 ° C עבור דג זברה) ו- 24 ± 1 ° C עבור FHM, מחזור/כהה מוגדר מבוקרי טמפרטורה חממות לאורך כל תקופת החשיפה. בנוסף, הטמפרטורה של המעבדה שבו יירשמו התנהגויות כדאי להישמר בתנאים קירוב ניסיוני תנאים כדי למנוע השפעות הטמפרטורה על התנהגויות. עוד, בארות בשימוש במהלך תצפיות התנהגותיות צריך להישמר בווליום עקבית עבור כל דג בודדים.
הזחל, עובריים דג זברה ש-pmrs בעבר השתמשו במדעים ביו כדי לזהות מטרות טיפוליות אפשריות עבור הרומן תרכובות12,13. פרוטוקול זה מרחיב על מחקר התנהגותי קודם עם דג זברה על ידי ניצול 38 נקודות קצה לחקור אתריים כימי של מזהמים סביבתיים. למרות הקפאין הוא מזהם הימית משותף עם מנגנון מובן של פעולה (מואה), תרכובות רבות במסחר חסרים נתונים מכניסטית חשובים. לכן, פרוטוקול זה יכול להיות מועסק כדי לקבל תובנה של MoAs עבור תרכובות חסר רעילות נתונים, לרבות כימיקלים מסחרי39. יתר על כן, הפרוטוקול מספק שיטות עבור שני המודלים דג הנפוץ ביותר. כמו שצוין לעיל, ואילו דג זברה הוא דגם דגים ביו נפוץ זה נהיה יותר ויותר פופולרי ב ecotoxicology, פאטהד את מינו משמשת כמודל האקולוגית ליישומים הערכת הסביבה אך קיבל יחסית פחות. תשומת לב במחקרים התנהגותיים עם מערכות אוטומטיות לעומת את דג זברה. למרות נותר אין שיטות הרגולציה מתוקננת ללימודי טוקסיקולוגיה סביבתית דגים, פרוטוקול זה מספק גישה לתמיכה המאמצים העתידיים.
קפאין elicited תגובות התנהגותיות בכל אחד מן הדגמים דגים ברמות זה זוהו אצל ה16של הסביבה הימית. רודריגז-גיל ואח . 2018 פיתחו חשיפה סביבתית גלובלית הפצות במערכות הימית, בהתבסס על ערכים נמדד קפאין16. באופן ספציפי, 95% של ריכוזים קולחים בשפכים החזוי יפול מתחת LOECs הקצה התנהגותית הרגישים ביותר של מינו דג זברה, פאטהד במחקר הנוכחי (טבלה 2). למרות כמה תופעות התנהגותיות של קפאין נצפתה דג זברה (במיוחד בתנאים כהה) ברמות הרלוונטיות. לסביבה, לא ברור אם לבצע שינויים התנהגותיים אלה עלול להתרחש אוכלוסיות הדגים טבעיים או התוצאה תוצאות שליליות חשוב מבחינה אקולוגית. למרות שימושי למטרות ההקרנה רגיש, אבחון, ספי התנהגותית זחל דגים לא יכול להיות נציג של שלבים אחרים על החיים או דגים באוכלוסיות טבעיות. נדרש מחקר נוסף כדי לקבוע אם דומה סף התגובה ההתנהגותית להתרחש בטבע, להיות מעידה על תוצאות שליליות ברמות הפרט או אוכלוסייה של הארגון הביולוגי.
The authors have nothing to disclose.
תמיכה עבור מחקר זה סופק על ידי קרן המדע הלאומית בארה ב (פרויקט #: צ’ה-1339637) עם תמיכה נוספים של הסוכנות להגנת הסביבה ארה ב. אנו מודים ד ר Jone Corrales, ד ר לורן Kristofco, Saari גבין, שמואל חדד, ומנהרן העורקים Burket, ברידג’ט היל לתמיכה כללית מעבדה.
ViewPoint Zebrabox | ViewPoint | ZebraLab and ZebraLab platform for automated behavioral observations | |
Caffeine | Sigma-Aldrich | C0750-100G | Study chemical |
Incubator | VWR | 9110589 | Maintains light/dark cycle and temperature for fathead minnow experiments |
Incubator | Thermo Fisher Scientific | 35824-636 | Maintains light/dark cycle and temperature for zebrafish experiments |
100 ml glass beakers | VWR | 89000-200 | Zebrafish exposure chambers |
500 ml glass beakers | Pyrex | EW-34502-03 | Fathead minnow exposure chambers |
5000 µl auto-pipette | Eppendorf | Research 5000 | Used to fill individual wells in well plates |
Transfer Pippettes | VWR | 414-004-004 | Used to transfer study organisms |
48-well plates | Fisher Scientific | 08-772-52 | Larval zebrafish behavioral recording chambers |
24-well plates | VWR | 10062-896 | Larval fathead minnow behavioral recording chambers |
Calcium sulfate dihydrate | Sigma-Aldrich | C3771 | For reconstituted hard water |
Magnesium Sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | For reconstituted hard water |
Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | For reconstituted hard water |
Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | For reconstituted hard water |
z-mod recirculating system | Marine Biotech Systems | Recirculating system to maintian zebrafish cultures | |
Statistical analysis software | Sigma Plot | Version 13.0 | Used to analyze beahvioral data and produce figures |
Statistical analysis software | Graphpad Prism | Prism 5 | Used to produce figures |
Autosampler/quaternary pumping system | Agilent Technologies | Infinity 1260 model | Analytical verification of caffeine treatment levels |
Jet stream thermal gradient electrospray ionization source | Agilent Technologies | Analytical verification of caffeine treatment levels | |
Triple quadrupole mass analyzer | Agilent Technologies | Model 6420 | Analytical verification of caffeine treatment levels |
10 cm × 2.1 mm Poroshell 120 SB-AQ column (120Å, 2.7) | Agilent Technologies | 685775-914T | Caffiene chromatography |
MassHunter Optimizer Software | Agilent Technologies | Determine the ionization mode, monitored transitions, and instrumental parameters for caffeine/caffeine-d9 and paraxanthine/paraxanthine-d6 |