Funcionalidad de la célula beta es importante para la homeostasis de la glucosa en sangre, que es evaluada en unicelulares resolución usando un reportero genéticamente codificado para la afluencia del calcio.
Las células beta pancreáticas responden al aumentar las concentraciones de glucosa de la sangre secretando la hormona insulina. La disfunción de las células beta conduce a hiperglucemia y consecuencias graves, potencialmente mortales. Entender cómo las células beta funcionan bajo condiciones fisiológicas y qué factores genéticos y ambientales podrían causar su disfunción podría conducir a mejores opciones de tratamiento para los pacientes diabéticos. La capacidad de medir niveles de calcio en las células beta es un indicador importante de la función de células beta, como la afluencia de calcio iones desencadena la liberación de insulina. Aquí se describe un protocolo para el monitoreo de la afluencia del calcio estimulada por la glucosa en las células beta pez cebra utilizando GCaMP6s, un sensor genéticamente codificado de calcio. El método permite el control de la dinámica del calcio intracelular con resolución unicelular en islotes ex vivo montado. La respuesta de la glucosa de las células beta en el mismo islote puede capturar simultáneamente con concentraciones diferentes de glucosa, que sugiere la presencia de heterogeneidad funcional entre las células beta de pez cebra. Además, la técnica proporciona alta resolución temporal y espacial, que revela la naturaleza oscilatoria de la afluencia del calcio sobre el estímulo de glucosa. Nuestro enfoque abre las puertas para utilizar el pez cebra como modelo para investigar la contribución de factores genéticos y ambientales en función de las células beta y la disfunción.
Nuestra glucosa en sangre se mantiene en un margen estrecho, en gran parte debido a la función del páncreas endocrino. La función endocrina del páncreas se realiza por los islotes de Langerhans, que contienen células secretoras de hormonas. Las células beta secretoras de insulina están responsables de reducir los niveles de glucosa en sangre después de una comida que contiene hidratos de carbono. Secreción inadecuada de insulina de células beta puede resultar en diabetes1, que se caracteriza por glucemia alta sostenida. Tipo 1 y tipo 2 Diabetes, que actualmente afecta a más de 400 millones de personas en todo el mundo, conduce a la morbilidad y la mortalidad2. Investigando los factores moleculares y ambientales que contribuyen a la disfunción de células beta, entenderemos mejor cómo diabetes tipo 2 se inicia y progresa. Además, la capacidad de diferenciar células madre humanas en células beta funcionales en vitro puede proporcionar una fuente de nuevas células beta para terapias de reemplazo celular en la Diabetes de tipo 1. Para ello, es importante estudiar la función de células beta y la maduración en organismos modelo genética con el fin de adquirir los conocimientos necesarios para hacer funcional de las células beta en un plato.
Funcionalidad de la célula beta puede controlarse en el plano de conjunto-islote mediante la cuantificación de la cantidad total de insulina secretada en respuesta al estímulo de glucosa. Este enfoque acumulativo estudia el islote como un único grupo de células sin diferenciar propiedades individuales de la célula. Sin embargo, el análisis de las respuestas de glucosa de células beta individuales reveló una diversidad en las propiedades funcionales de las células beta y la presencia de heterogeneidad3. Para evaluar la función de individual de las células beta, es posible monitorizar los cambios intracelulares que conducen a la secreción de insulina4. La secreción de insulina es precedida por una entrada de la glucosa en las células beta. La glucosa que entra en las células beta se metaboliza rápidamente a ATP. Altas concentraciones de ATP intracelulares disminuyen la probabilidad abierta de los canales de ion de potasio ATP-sensibles a la despolarización de la célula beta. Despolarización abre los canales de iones de calcio sensibles al voltaje y aumenta el calcio intracelular. A su vez, calcio desencadena la exocitosis de la insulina, que se libera en la circulación y reduce los niveles de glucosa promoviendo la utilización de la glucosa5,6,7.
Varias estrategias se han aplicado para investigar la función de las células beta, incluyendo el monitoreo del potencial de la membrana8, la visualización directa de la insulina-vesículas exocitosis9y cuantificación de Ca intracelular2 + afluencia como un proxy para glucosa respuesta10. Entre ellos, la proyección de imagen de Ca intracelular2 + proporciona la ventaja de la ampliación del análisis a varias células individuales en el mismo islote11,12, lo que permite la comparación directa de la capacidad de respuesta de glucosa entre individuales-las células beta. Concentración de Ca2 + intracelular puede controlarse usando colorantes fluorescentes sensibles a calcio13 o calcio genéticamente codificado indicadores (GECIs)14. Mientras que la especificidad de tipo de la célula falta calcio indicador tintes, GECIs puede expresarse en un tipo de célula específica por promotores específicos. Además, la nueva generación de GECIs, como GCaMP6, proporciona mejor relación de señal a ruido junto con el más rápido de la dinámica temporal15. Aquí describimos la utilidad de la nueva generación de GECIs, en particular GCaMP6s, para visualizar calcio en las células beta en resolución unicelular. Aplicamos este método al islote principal del pez cebra como modelo de elección. Durante el desarrollo embrionario, las células beta en el islote principal originan la dorsal y ventral páncreas yemas16. El islote principal está situado en una posición anatómica estereotipada en el páncreas de pez cebra, lo que permite su fácil identificación y el aislamiento. Las células beta en el islote principal son necesarias para la regulación de la glucosa, como la ablación genética conduce a hiperglucemia17,18. Además, estas células beta se convierten en glucosa responden durante temprano pez cebra desarrollo19. Este protocolo puede aplicarse también a la proyección de imagen los islotes secundarios, que forman durante las etapas post-embrionarias. El protocolo permite imagen beta de células ex vivo, en etapas posteriores de desarrollo y en las concentraciones de glucosa definida.
Aquí se demuestra una técnica para la cuantificación de la capacidad de respuesta de glucosa células beta en resolución unicelular. Esto es posible mediante el control de la concentración de calcio intracelular mediante un indicador de calcio codificado genéticamente, GCaMP6s. La actividad de la célula beta es capturado ex vivo montando el islote en un molde de trombina fibrinógeno. Un paso fundamental del protocolo es la estabilidad del molde. Tiempo suficiente se debe prestar para que el fibrinógeno disolver en la solución HBSS. Sin esto, el molde no polimerizar suficientemente para proporcionar estabilidad durante la sesión de imágenes. Un islote montadas en molde de trombina fibrinógeno e inmersos en medios de cultivo celular puede permanecer viable durante por lo menos una semana (datos no mostrados). Alternativas para el molde del fibrinógeno trombina, como la agarosa de la bajo-derretir, pueden ser utilizadas para montar el islote22. Otro parámetro importante es la disección del islote. Durante este paso, el tejido que rodea el islote debe removerse sin dañar o meter el islote. Una hábil disección viene con la práctica.
Una limitación del Protocolo de imagen es la restricción a un solo plano confocal del islote. Esto se hace para capturar la dinámica de la afluencia del calcio dentro de las individuales de células beta. Una pila de Z a través de todo el espesor de la isla conduce a bajas velocidades de imagen y la pérdida de señal oscilatoria de células individuales. Esta limitación podría mejorarse mediante el uso de medios más rápidos-proyección de imagen confocal como microscopía de disco giratorio, para capturar la dinámica del calcio en 3 dimensiones. Otra frontera sería en vivo calcio imagen12. La naturaleza transparente del embrión de pez cebra o el uso de cepas menos pigmento de pez cebra adultos23 podría abrir la posibilidad de que en vivo la proyección de imagen en el futuro.
La proyección de imagen de la actividad de células beta en la alta resolución espacial y temporal permite para investigar la heterogeneidad funcional entre individuales de las células beta. Este enfoque puede ayudar a arrojar luz sobre la existencia de subpoblaciones de células beta. Recientemente, varios estudios han demostrado la existencia de subpoblaciones en la nominalmente homogénea de las células beta24,25,26. Ex vivo la proyección de imagen puede combinarse con reporteros genéticas para la caracterización de la respuesta de la sub-población a la glucosa. Además, la combinación de la configuración de imagen con estimulación farmacológica permite para la detección de compuestos que podrían mejorar la funcionalidad de la célula beta.
En Resumen, la técnica presentada aquí permite la cuantificación y la comparación de la capacidad de respuesta de glucosa para cada de las células beta. Proporciona una ventana directa a la funcionalidad de la célula beta, un parámetro importante en el desarrollo de la diabetes.
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos a miembros del laboratorio Ninov para comentarios sobre el manuscrito, los miembros del centro de Dresde de terapias regenerativas (CRTD) pescado y microscopía para asistencia técnica. N.N. es apoyado por fondos de la DFG-CRTD, racimo de la excelencia en TU Dresden, Fundación de investigación alemana (DFG) y del centro alemán de investigación de la Diabetes (DZD).
Transgenic Zebrafish line: Tg(ins:nls-Renilla-mKO2; cryaa:CFP); Tg(ins:GCaMP6s; cryaa:mCherry) | By request from authors | ||
Stereo microscope | ZEISS | 495015-0001-000 | SteREO Discovery.V8 |
Fluorescence lamp | ZEISS | 423013-9010-000 | Illuminator HXP 120 V |
Red Filter Cube | ZEISS | 000000-1114-462 | Filter set 45 HQ TexasRed |
Confocal Microscope | ZEISS | LSM 780 | |
Bovine fibrinogen | Sigma | F8630 | |
HBSS (Hanks' Balanced Salt solution) | ThermoFisher | 14025092 | |
Thrombin | Sigma | T4648 | |
D-Glucose | Sigma | G8270 | |
KCl | Sigma | P9333 | |
35 mm diameter glass-bottom dishes | ThermoFisher | 150680 | |
tricaine methane sulfonate | Sigma | E10521 | |
Fine Forceps | Fine Science Tools | 11445-12 | |
FIJI, using ImageJ Version: 2.0.0-rc-43/1.50e | https://fiji.sc/ | ||
R, version 3.2.4 | https://www.r-project.org/ | ||
RStudio | https://www.rstudio.com/ | ||
plotcelltrace.R | A custom script provided with the manuscript |