المهم وظيفة خلايا بيتا للتوازن الجلوكوز في الدم، الذي يتم تقييمه في خلية واحدة قرار استخدام مراسل وراثيا مرمزة لتدفق الكالسيوم.
خلايا بيتا في البنكرياس الاستجابة لتزايد تركيزات الجلوكوز في الدم بإفراز هرمون الأنسولين. اختلال وظيفي خلايا بيتا يؤدي إلى ارتفاع السكر في الدم وعواقب خطيرة، تهدد الحياة. فهم كيف تعمل خلايا بيتا تحت الظروف الفسيولوجية والعوامل الوراثية والبيئية التي قد يتسبب بها خلل يمكن أن يؤدي إلى أفضل خيارات العلاج لمرضى السكري. القدرة على قياس مستويات الكالسيوم في خلايا بيتا بمثابة مؤشر هام على وظيفة خلايا بيتا، كتدفق أيونات الكالسيوم المشغلات الأنسولين الإفراج. هنا يصف لنا بروتوكول لرصد تدفق الكالسيوم حفزت الجلوكوز في خلايا بيتا الزرد باستخدام GCaMP6s، جهاز استشعار مرمزة وراثيا من الكالسيوم. يسمح الأسلوب رصد ديناميات الكالسيوم داخل الخلايا مع القرار خلية واحدة في الجزيرات السابقين فيفو الخيالة. الجلوكوز-استجابة خلايا بيتا داخل الجزيرة نفسها يمكن التقاط في وقت واحد تحت تركيزات الجلوكوز مختلفة، مما يوحي بوجود تغاير الوظيفية بين خلايا بيتا الزرد. وعلاوة على ذلك، توفر التقنية عالية الدقة الزماني والمكاني، الذي يكشف عن طبيعة تدفق الكالسيوم عند تنشيط الجلوكوز متذبذبة. لدينا نهج يفتح الأبواب أمام استخدام الزرد كنموذج للتحقيق في مساهمة العوامل الوراثية والبيئية لوظيفة خلايا بيتا والخلل الوظيفي.
الحفاظ على السكر في الدم لدينا في نطاق ضيق، في جزء كبير منه بسبب الوظيفة البنكرياس الغدد الصماء. ويقوم دور الغدد الصماء في البنكرياس بجزر لانجرهانز، التي تحتوي على خلايا إفراز الهرمونات. خلايا بيتا إفراز الأنسولين المسؤولة عن الحد من مستويات الجلوكوز في الدم بعد وجبة المحتوية على الكربوهيدرات. يمكن أن يؤدي إفراز الأنسولين غير كاف من خلايا بيتا في داء السكري1، التي تتسم جلوكوز الدم العالي المستمر. نوع 1 ونوع 2 مرض السكري، الذي يصيب حاليا أكثر من 400 مليون شخص في العالم، يؤدي إلى الإصابة بالأمراض والوفيات2. بالتحقيق في العوامل الجزيئية والبيئية التي تسهم في ضعف خلايا بيتا، سوف نفهم أفضل كيف يبدأ مرض السكري من النوع 2 وتقدم. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن توفر القدرة على التفريق بين خلايا جذعية بشرية إلى خلايا بيتا الوظيفية في المختبر مصدرا لخلايا بيتا جديداً لعلاجات استبدال الخلية في مرض السكري من النوع 1. وتحقيقا لهذه الغاية، من المهم دراسة وظيفة خلايا بيتا والنضج في الكائنات نموذج الجينية من أجل اكتساب المعرفة اللازمة لجعل خلايا بيتا الوظيفية في طبق.
يمكن رصد وظيفة خلايا بيتا على مستوى الجامعة-جزيرة ليلى بتحديد مقدار المبلغ الإجمالي للأنسولين ويفرز استجابة للتحفيز الجلوكوز. هذا النهج التراكمي الدراسات جزيرة ليلى كمجموعة واحدة من الخلايا دون التفريق بين الخصائص الفردية في خلية. ومع ذلك، كشف تحليل الردود الجلوكوز لخلايا بيتا الفردية تنوع في الخصائص الوظيفية لخلايا بيتا ووجود عدم تجانس3. من الممكن لتقييم وظيفة خلايا بيتا الفردية، لرصد التغييرات داخل الخلايا التي تؤدي إلى إفراز الأنسولين4. يسبق إفراز الأنسولين بإدخال الجلوكوز في خلايا بيتا. يتم استقلاب الجلوكوز الذي يدخل في خلايا بيتا سرعة إلى ATP. أعلى تركيزات ATP داخل الخلايا إنقاص احتمال فتح قنوات أيون البوتاسيوم الحساسة ATP المؤدية إلى خلايا بيتا depolarization. ديبولاريزيشن يفتح قنوات أيون الكالسيوم المراعية للجهد ويزيد الكالسيوم داخل الخلايا. وفي المقابل، مشغلات الكالسيوم الرقابة للأنسولين، الذي صدر في الدورة الدموية، ويخفض مستويات السكر بتشجيع استخدام الغلوكوز5،،من67.
وقد طبقت عدة استراتيجيات للتحقيق في وظيفة خلايا بيتا، بما في ذلك الرصد المحتملة غشاء8، والتصور المباشر للأنسولين-حويصلات الرقابة9، والتحديد الكمي لكاليفورنيا داخل الخلية2 + تدفق كوكيل لاستجابة الجلوكوز10. فيما بينها، يوفر التصوير من كاليفورنيا داخل الخلية2 + استفادة زيادة التحليل إلى خلايا فردية متعددة داخل نفس جزيرة11،12، تسمح بإجراء مقارنة مباشرة للسكر-الاستجابة بين خلايا بيتا الفردية. يمكن رصدها داخل الخلية Ca2 + تركيز استخدام الأصباغ الفلورية المراعية للكالسيوم13 أو المرمزة وراثيا الكالسيوم المؤشرات (جيسيس)14. حيث يمكن التعبير عن الكالسيوم مؤشر الأصباغ الافتقار إلى خلية من نوع خصوصية، جيسيس في نوع خلية معينة من المروجين محددة. بالإضافة إلى ذلك، يوفر الجيل الجديد من جيسيس، مثل GCaMP6، نسبة الإشارة إلى الضوضاء أفضل جنبا إلى جنب مع ديناميات الزمانية أسرع15. هنا يصف لنا الفائدة من أن الجيل الجديد من جيسيس، في GCaMP6s معينة، تصور الكالسيوم في خلايا بيتا في القرار خلية واحدة. نطبق هذا الأسلوب إلى جزيرة الزرد الأولية كنموذج لدينا من خيار. أثناء التطور الجنيني، خلايا بيتا في جزيرة الأساسية تنبع من الظهرية والبنكرياس البطني براعم16. جزيرة الرئيسي يقع في موضع تشريحي نمطية داخل البنكرياس الزرد، يمكن سهولة تحديد وعزل. خلايا بيتا في جزيرة الأولية ضرورية لتنظيم الجلوكوز، على الاجتثاث الوراثية يؤدي إلى ارتفاع السكر في الدم17،18. وعلاوة على ذلك، أصبحت هذه خلايا بيتا المراعية للسكر خلال وقت مبكر الزرد التنمية19. يمكن أيضا تطبيق هذا البروتوكول للتصوير الجزيرات الثانوية، التي تشكل المراحل الجنينية بعد. يسمح البروتوكول للصورة خلايا بيتا السابقين فيفو، في مراحل لاحقة من التنمية وتركيزات الجلوكوز محددة.
هنا نظهر تقنية للتحديد الكمي لاستجابة الجلوكوز خلايا بيتا في القرار خلية واحدة. أصبح هذا ممكناً من قبل رصد تركيز الكالسيوم داخل الخلايا باستخدام مؤشر كالسيوم المرمزة وراثيا، GCaMP6s. نشاط خلايا بيتا من الأسرى السابقين فيفو متصاعدة على الجزيرة الصغيرة في العفن الفيبرينوجين-ثرومبين. خطوة حاسمة للبروتوكول هو استقرار القالب. وقت كاف ينبغي إيلاء الفيبرينوجين حل في حل حبس. وبدون هذا بلمرة العفن لا بما فيه الكفاية لتوفير الاستقرار أثناء الدورة التصوير. يمكن أن تبقى جزيرة ليلى التي شنت في الفيبرينوجين-ثرومبين العفن ومنغمسين في خلية ثقافة وسائل الإعلام قادرة على البقاء لمدة أسبوع على الأقل (البيانات لا تظهر). يمكن استخدام بدائل للعفن الفيبرينوجين-ثرومبين، مثل ذوبان منخفضة [اغروس]، جبل جزيرة ليلى22. المعلمة حاسم آخر هو التشريح لجزيرة ليلى. أثناء هذه الخطوة، الأنسجة المحيطة بجزيرة ليلى يحتاج إلى إزالة دون إصابة أو دس جزيرة ليلى. ويأتي تشريح ماهراً مع الممارسة.
تحديد بروتوكول التصوير هو التقييد لطائرة [كنفوكل] واحدة من جزيرة ليلى. ويتم ذلك لالتقاط ديناميات تدفق الكالسيوم داخل خلايا بيتا الفردية. Z-كومة من خلال سمك كامل الجزيرة يؤدي إلى انخفاض التصوير بسرعة وفقدان الإشارة متذبذبة من الخلايا الفردية. ويمكن تحسين هذا القيد باستخدام أسرع وسائل [كنفوكل]-التصوير مثل الغزل-القرص المجهري، لتمكين أسر ديناميات الكالسيوم في 3-الأبعاد. وستكون آخر الحدود في فيفو الكالسيوم التصوير12. يمكن فتح الطبيعة الشفافة للجنين الزرد أو استخدام سلالات صباغ-أقل من الزرد البالغين23 إمكانية في فيفو التصوير في المستقبل.
يمكن تصوير نشاط خلايا بيتا في عالية الدقة المكانية والزمانية للتحقيق في عدم تجانس وظيفي بين خلايا بيتا الفردية. هذا النهج يمكن أن تساعد في تسليط الضوء على وجود خلايا بيتا السكان الفرعية. في الآونة الأخيرة، أظهرت دراسات متعددة بوجود السكان الفرعية في خلايا بيتا اسمياً متجانسة24،،من2526. يمكن أن يقترن السابقين فيفو تصوير الصحفيين الوراثية لتوصيف الفرعية السكان استجابة للسكر. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تسمح الجمع بين الإعداد التصوير مع التحفيز الدوائي لفحص المركبات التي يمكن أن تحسن وظيفة خلايا بيتا.
وباختصار، يسمح التقنية المقدمة هنا القياس الكمي ومقارنة مدى استجابة الجلوكوز لخلايا بيتا الفردية. ويوفر نافذة مباشرة في وظيفة خلايا بيتا، معياراً هاما في تطور مرض السكري.
The authors have nothing to disclose.
ونشكر أعضاء المختبر نينوف للتعليقات على المخطوطة، أعضاء من مركز لمرفق درسدن العلاجات التجدد (الاتفاقية) الأسماك والفحص المجهري للمساعدة التقنية. ن. ن. هو مدعومة بتمويل من DFG الاتفاقية، “الكتلة للتميز” في درسدن تو، ومؤسسة البحوث الألمانية (DFG)، والمركز الألماني لبحوث مرض السكري (DZD).
Transgenic Zebrafish line: Tg(ins:nls-Renilla-mKO2; cryaa:CFP); Tg(ins:GCaMP6s; cryaa:mCherry) | By request from authors | ||
Stereo microscope | ZEISS | 495015-0001-000 | SteREO Discovery.V8 |
Fluorescence lamp | ZEISS | 423013-9010-000 | Illuminator HXP 120 V |
Red Filter Cube | ZEISS | 000000-1114-462 | Filter set 45 HQ TexasRed |
Confocal Microscope | ZEISS | LSM 780 | |
Bovine fibrinogen | Sigma | F8630 | |
HBSS (Hanks' Balanced Salt solution) | ThermoFisher | 14025092 | |
Thrombin | Sigma | T4648 | |
D-Glucose | Sigma | G8270 | |
KCl | Sigma | P9333 | |
35 mm diameter glass-bottom dishes | ThermoFisher | 150680 | |
tricaine methane sulfonate | Sigma | E10521 | |
Fine Forceps | Fine Science Tools | 11445-12 | |
FIJI, using ImageJ Version: 2.0.0-rc-43/1.50e | https://fiji.sc/ | ||
R, version 3.2.4 | https://www.r-project.org/ | ||
RStudio | https://www.rstudio.com/ | ||
plotcelltrace.R | A custom script provided with the manuscript |