תאי בטא פונקציונליות חשוב הומאוסטזיס הגלוקוז בדם, אשר מוערך ברזולוציה תא בודד באמצעות כתב גנטית מקודד עבור זרם סידן.
בתאי בטא בלבלב להגיב הגדלת ריכוזים של גלוקוז בדם על ידי הפרשת הורמון ה אינסולין. תפקוד תאי בטא-מוביל היפרגליקמיה השלכות חמורות, סכנת חיים. הבנת איך תאי הבטא פועלים בתנאים פיזיולוגיים, איזה גורמים גנטיים וסביבתיים עלול לגרום שלהם לקוי עלול להוביל אפשרויות טיפול טובות יותר עבור חולי סוכרת. היכולת למדוד את רמות הסידן בתאים-בטא מהווה אינדיקטור חשוב של תפקוד תאי בטא, כמו זרם של שחרור אינסולין גורמים מפעילים של יונים של סידן. כאן נתאר פרוטוקול עבור ניטור זרם סידן מגורה-גלוקוז בתאים-דג זברה בטא באמצעות GCaMP6s, חיישן מקודדים גנטית של סידן. השיטה מאפשרת ניטור הדינמיקות סידן תאיים עם רזולוציה תא בודד ב- לשעבר vivo רכוב איונים. הגלוקוז-התגובה של תאי הבטא בתוך איון אותו ניתן ללכוד בו זמנית תחת ריכוזי גלוקוז שונים, אשר מצביע על הנוכחות של הטרוגניות פונקציונלי בין דג זברה בטא-תאים. יתר על כן, השיטה מספקת הגיאופוליטיות והמרחביות טמפורלית ברזולוציה גבוהה, אשר חושף את מהות מתנדנדות זרם סידן על גירוי גלוקוז. הגישה שלנו פתיחת הדלתות כדי להשתמש את דג זברה כמודל כדי לחקור את התרומה של גורמים גנטיים וסביבתיים אל תאי בטא ותפקוד לקוי.
הגלוקוז בדם שלנו נשמר בטווח צר, בעיקר בזכות הפונקציה בלבלב האנדוקרינית. תפקיד האנדוקרינית הלבלב מתבצע על ידי איי לנגרהנס, אשר מכילים תאים מפריש הורמון. הורמון האינסולין-תאי הבטא אחראים הפחתת רמות הגלוקוז בדם לאחר ארוחה המכילה פחמימות. הפרשת האינסולין לקוי של תאי בטא יכול לגרום סוכרת1, אשר מאופיין על ידי מתמשכת הגלוקוז בדם גבוהה. סוג 1 וסוכרת מסוג 2, אשר פוגעת כיום יותר מ- 400 מיליון אנשים ברחבי העולם, מוביל התחלואה והתמותה2. על ידי חוקר את הגורמים המולקולריים וסביבתיים שתורמים בתפקוד תאי בטא, אנחנו יבין טוב יותר איך לפתח סוכרת מסוג 2 מתחיל ולא מתקדמת. בנוסף, היכולת להבדיל תאי גזע אנושי לתוך תאי הבטא פונקציונלי במבחנה יכול לספק מקור של בטא-תאים חדשים תא-החלפת טיפולים בסוכרת מסוג 1. לשם כך, חשוב ללמוד ההבשלה מודל גנטי אורגניזמים ותפקוד תאי בטא כדי להשיג את הידע הדרוש לייצור תאי הבטא פונקציונלי בקערה.
תאי בטא פונקציונליות ניתן לנטר באותה רמת שלמה-איון מאת לכימות הסכום הכולל של אינסולין מופרש בתגובה גלוקוז-גירוי. גישה זו מצטברת מחקרים של איון כקבוצה אחת של תאים ללא הבחנה המאפיינים הבודדים של התא. עם זאת, ניתוח הנתונים של גלוקוז תגובות של בטא-תאים בודדים גילה מגוון המאפיינים הפונקציונליים של תאי ביתא-ואת הנוכחות של הטרוגניות3. כדי להעריך את הפונקציה של בטא-תאים בודדים, זה אפשרי לעקוב אחר שינויים תאיים להוביל הפרשת אינסולין4. הפרשת האינסולין קודם כניסה של גלוקוז לתוך תאי הבטא. גלוקוזה זה מזין תאי הבטא עובר מטבוליזם במהירות ל ATP. ריכוז גבוה של ATP תאיים להקטין את ההסתברות פתוח של תעלות יונים של אשלגן תלויית ATP המוביל אל תאי בטא דפולריזציה. דפולריזציה פתיחת תעלות היונים מתח רגיש סידן ומגביר את הסידן תאיים. בתורו, הסידן מפעיל אקסוציטוזה של אינסולין, אשר מופץ במחזור הדם, מוריד את רמות הגלוקוז על ידי קידום גלוקוז-ניצול5,6,7.
מספר אסטרטגיות הוחלו לחקור את תפקוד תאי הבטא, כולל ניטור של פוטנציאל הממברנה8, פריט חזותי ישיר של אינסולין-שלפוחית אקסוציטוזה9, כימות של Ca תאיים2 + זרם כמדד גלוקוז-תגובתיות10. ביניהם, הדמיה של Ca תאיים2 + מספק את היתרון של הניתוח בתאים בודדים מרובים בתוך אותו איון11,12, המאפשר השוואה ישירה של הגלוקוז-התגובה בין למעלה-קנה מידה בטא-תאים בודדים. Ca תאיים2 + ריכוז ניתן לנטר בעזרת צבעי פלורסנט סידן רגיש13 או סידן מקודד גנטית אינדיקטורים (GECIs)14. ואילו סידן-מחוון צבע חוסר סוג התא ירידה לפרטים, GECIs יכול להתבטא סוג תא מסוים על ידי היזמים ספציפיים. בנוסף, הדור החדש של GECIs, כגון GCaMP6, מספק יחס אות לרעש טוב יותר יחד עם מהר טמפורלית dynamics15. כאן נתאר את התועלת של הדור החדש של GECIs, ב GCaMP6s מסוים, כדי להמחיש סידן בתאי בטא ברזולוציה תא בודד. אנו מיישמים שיטה זו כדי איון העיקרי דג זברה כמודל שלנו להתמקד. במהלך התפתחות עובריים, ביתא-תאים איון הראשי מקורן מהראש, הלבלב הגחוני / ניצנים16. איון העיקרי הינו ממוקם במיקום האנטומי סטריאוטיפי בתוך הלבלב דג זברה, המאפשרת בידוד וזיהוי קל שלה. בטא-תאים איון העיקרי נחוצים גלוקוז-תקנה, כפי אבלציה הגנטי שלהם מוביל היפרגליקמיה17,18. יתר על כן, הביתא-תאים אלה הופכים גלוקוז מגיב במהלך התפתחות מוקדמת של דג זברה19. פרוטוקול זה ניתן להחיל גם על הדמיה איונים המשני, המהווים בשלבים עובריים פוסט. הפרוטוקול מאפשר תמונה תאי בטא- ex-vivo, בשלבים מאוחרים יותר של התפתחות ותחת ריכוזי גלוקוז מוגדרים.
כאן אנחנו מדגימים טכניקה עבור כימות של תאי בטא תגובתיות גלוקוז ברזולוציה תא בודד. זה התאפשר על ידי ניטור ריכוז הסידן תאיים באמצעות מחוון בקידוד גנטית סידן, GCaMP6s. פעילות תאי בטא היא הלכוד שמחוץ על ידי הרכבה של איון בתבנית פיברינוגן-תרומבין. שלב קריטי של הפרוטוקול הוא היציבות של העובש. מספיק זמן צריך להינתן עבור פיברינוגן להמיס הפתרון HBSS. בלי זה, כייר לא פולימריזציה מספיק כדי לספק יציבות במהלך הפגישה הדמיה. איון הוטענו פיברינוגן-תרומבין עובש, שקוע בתוך התא תרבות המדיה יכול להישאר בר קיימא לשבוע לפחות (נתונים לא מוצג). חלופות כייר פיברינוגן-תרומבין, כגון agarose נמוך-להמיס, יכול להיות מנוצל כדי לטעון את איון22. פרמטר קריטי נוסף הוא ניתוח איון. במהלך שלב זה, רקמות המקיפים את איון צריך להיות מוסר ללא ופצעו או תוקע איון. . הקרע מיומן מגיע עם תרגול.
מגבלה של פרוטוקול הדמיה הוא צמצום למישור קונאפוקלית אחד של איון. זה נעשה כדי ללכוד את הדינמיקה של סידן זרם בתוך ביתא-תאים בודדים. Z-מחסנית דרך כל עובי איון מוביל נמוך הדמיה מהירויות, לאבדן קשר מתנדנדות תאים בודדים. מגבלה זו יכולים להשתפר תוך שימוש באמצעים מהירים קונאפוקלית-הדמיה כגון מיקרוסקופ ספינינג-דיסק, כדי לאפשר את הדינמיקה סידן בממדים-3. גבול נוסף יהיה ויוו סידן הדמיה12. הטבע שקוף של דג זברה העובר או השימוש של פיגמנט-פחות זנים של דג זברה מבוגרים23 היתה לפתוח את האפשרות ויוו הדמיה בעתיד.
ההדמיה של פעילות תאי בטא ברזולוציה גבוהה יכולות מאפשר לחקור את הטרוגניות פונקציונלי בין ביתא-תאים בודדים. גישה זו יכולה לסייע לשפוך אור על קיומו של תאי בטא תת אוכלוסיות. לאחרונה, מחקרים רבים הראו קיומה של תת אוכלוסיות של תאי הבטא נומינלית הומוגנית24,25,26. Ex-vivo הדמיה ניתן לשלב עם כתבים גנטית כדי לאפיין מתגובה של תת-האוכלוסייה גלוקוז. בנוסף, שילוב של הגדרת הדמיה עם גירוי תרופתי יכול לאפשר להקרנה של תרכובות יכול לשפר את הפונקציונליות של תאי בטא.
לסיכום, הטכניקה המובאת כאן מאפשר כימות והשוואה בין התגובה גלוקוז בטא-לתאים בודדים. הוא מספק חלון ישירה לתוך תאי בטא פונקציונליות, פרמטר חשוב בהתפתחות סוכרת.
The authors have nothing to disclose.
אנו מודים חברי המעבדה Ninov להערות על כתב היד, חברי מרכז למתקן דגים, מיקרוסקופיה דרזדן טיפולים משובי (CRTD) לקבלת סיוע טכני. N.N. נתמך על ידי מימון DFG-CRTD, אשכול התמחות TU-דרזדן, קרן מחקר גרמני (DFG) ואל מרכז גרמנית עבור סוכרת מחקר (DZD).
Transgenic Zebrafish line: Tg(ins:nls-Renilla-mKO2; cryaa:CFP); Tg(ins:GCaMP6s; cryaa:mCherry) | By request from authors | ||
Stereo microscope | ZEISS | 495015-0001-000 | SteREO Discovery.V8 |
Fluorescence lamp | ZEISS | 423013-9010-000 | Illuminator HXP 120 V |
Red Filter Cube | ZEISS | 000000-1114-462 | Filter set 45 HQ TexasRed |
Confocal Microscope | ZEISS | LSM 780 | |
Bovine fibrinogen | Sigma | F8630 | |
HBSS (Hanks' Balanced Salt solution) | ThermoFisher | 14025092 | |
Thrombin | Sigma | T4648 | |
D-Glucose | Sigma | G8270 | |
KCl | Sigma | P9333 | |
35 mm diameter glass-bottom dishes | ThermoFisher | 150680 | |
tricaine methane sulfonate | Sigma | E10521 | |
Fine Forceps | Fine Science Tools | 11445-12 | |
FIJI, using ImageJ Version: 2.0.0-rc-43/1.50e | https://fiji.sc/ | ||
R, version 3.2.4 | https://www.r-project.org/ | ||
RStudio | https://www.rstudio.com/ | ||
plotcelltrace.R | A custom script provided with the manuscript |