Bu yazıda, biz T-bağımlı ve T-bağımsız immünglobulin (Ig) izotip yanıt ELISA kullanarak farelerde karakterize için bir protokol tanımlamak. Bu yöntem tek başına veya kullanılabilir akış ile birlikte sitometresi araştırmacılar T-bağımlı ve bağımsız T antijen bağışıklama takip farelerde B hücre-aracılı Ig izotip yanıtlarında farkları belirlemek için izin verir.
B lenfositler, humoral bağışıklık içinde plasmablasts/plazma hücreleri tarafından salgılanan immünoglobulinler (Ig), Ayrıştırılan olarak da adlandırılan antikorlar, çeşitli mekanizmalar yoluyla patojenler istila karşı müthiş bir savunma sağlar. Aşı bir ana amacı hayati enfeksiyonları önlemek için koruyucu antijen spesifik antikorlar teşvik etmektir. Hem timus bağlı (TD) ve timus bağımsız (TI) antijenleri sağlam antijen spesifik IgM yanıt-e doğru çıkarmak ve ayrıca izotip anahtarlamalı antikorlar (IgG, IgA ve IgE) üretimi yanı sıra bellek B hücreleri yardımıyla nesil neden olabilir antijen sunan hücreler (ZPT) tarafından sağlanan. Burada, TD ve TI Ig izotip yanıt enzim bağlı immunosorbent assay (ELISA) kullanarak farelerde karakterize için bir protokol açıklayın. Bu protokol için TD ve TI IG yanıt farelerde mayi (IP) aşılama ile hapten Birleşik modeli antijenleri TNP-KLH (şap içinde) ve TNP-polisakkarit (PBS) içinde tarafından sırasıyla elde edildi. TD bellek yanıt ikna etmek için 3 hafta sonra aynı antijen/adjuvan ile ilk aşılama TNP-KLH bir alttan yukarıya ittirmek aşı şap içinde verilir. Fare sera farklı zaman noktalarda öncesi ve sonrası aşılama hasat. Serum Ig düzeyleri toplam ve TNP özgü antikorların Ig izotip özel sandviç ve dolaylı ELISA, sırasıyla kullanarak daha sonra sayılabilir. Doğru her Ig izotip serum konsantrasyonu ölçmek için örnekleri uygun standart eğrileri doğrusal Aralık içinde sığacak şekilde seyreltilmiş gerekir. Bu iletişim kuralını kullanan, biz sürekli olarak güvenilir sonuçlar yüksek özgüllük ve hassasiyet elde etmiş olursunuz. Akış Sitometresi, dalak B hücreleri ve immunohistokimyasal vitro kültür gibi diğer tamamlayıcı Yöntemler ile birlikte kullanıldığında (IHC) boyama, bu iletişim kuralını araştırmacılar antikor kapsamlı bir anlayış kazanmak izin verir Yanıt verilen bir deneysel ortamda.
B lenfositler humoral bağışıklık asıl Player’da ve memelilerde aynı zamanda immünglobulin (Ig)1,2olarak adlandırılan antikorlar, üretebilen tek hücre tipi vardır. B hücreleri tarafından salgılanan antikorlar patojenler Nötralizasyon, opsonizasyonla ve kompleman aktivasyonu, koruyucu bağışıklık3‘ e lider gibi çeşitli mekanizmalar yoluyla istila karşı müthiş bir savunma sağlar. B hücreleri tarafından antikorların salgısının sadece normalde iki ayrı3sinyalleri gerektiren tam harekete geçirmek belirli B hücrelerinin sonra elde edilir. Sinyal 1 antijen (Ag) doğrudan bağlama tarafından belirli naif B hücreleri3yüzeyinde ifade B hücre reseptörü (BCR) için geçirilir. Sinyal 2 kaynağına bağlı olarak, B hücre aktivasyonu timus bağımlı (TD) veya timus bağımsız (TI)3,4bölünmüş olabilir. TD antijen yanıt olarak sinyal 2 CD154, co-stimulatory reseptör B hücreleri1,2,3ifade CD40 ligand hızlı harekete geçirmek soydaş CD4 T yardımcı (TH) hücreleri tarafından sağlanır. TI antijen yanıt olarak sinyal 2 Toll benzeri reseptörler ya nişan gelir (TLR 1 türü söz konusu olduğunda TI Ag) veya geniş BCRs ile ilişkilendirerek (tip 2 durumunda TI Ag)3,4B hücreleri. Tip 1 TI (TI-1) antijenleri TLRs, bakteriyel lipopolisakkaritler (LPS), viral RNA’ların ve mikrobiyal CpG DNA4,5gibi bir mikrobiyal ligandlar vardır. Tip 2 TI (TI-2) antijenleri son derece tekrarlayan yapıya sahip ve uzun süreli ve kalıcı birden çok BCRs4,6/ cross-linking tarafından için B hücre sinyallemesi teslim edebiliyoruz. Pnömokok polisakkaritler ve hapten Birleşik polisakkarit6,7TI-2 antijenleri ile ilgili örnekler içermektedir. TD ve TI antijenleri sağlam antijen spesifik IgM yanıt-e doğru çıkarmak ve ayrıca izotip anahtarlamalı antikorlar (IgG, IgA ve IgE) üretim hücreleri (ZPT) dendritik hücreler (DC)1 gibi sunulması antijen tarafından sağlanan yardımı ile neden olabilir ,2,3. Ayrıca, TD ve TI antijenleri bellek yanıtları ZPT yardımıyla ikna edebiliyoruz, ama TD antijenleri bellek B hücre üretimi3,8inducing verimlidir.
Bu protokol için TD ve TI IG yanıt farelerde hapten Birleşik modeli antijenleri 2,4,6-trinitrophenyl-anahtar deliği vantuzlu hemocyanin (TNP-KLH) ve TNP-polisakkarit (bağımsız çok dallı, mayi (IP) aşılama tarafından elde edildi ve yüksek-kütle), sırasıyla9,10,11. TD antijenleri genellikle bir adjuvan ile antikor12üretimini artırmak için kullanılır. Burada bizim iletişim kuralında, TNP-KLH şap, yaygın olarak kullanılan adjuvan aşılama çalışmaları12ile enjekte edilir. Tam ya da eksik Freund’s adjuvan (CFA veya IFA), kullanılabilir adjuvan diğer örnekler monophosphoryl-lipid A / trehalose dicorynomycolate (“Ribi” adjuvan) ve KSY oligodeoxynucleotides, vb13, 14. sera TNP özgü antikor sayısal kullanarak Ig izotip özgü enzim bağlı immunosorbent assay (ELISA)9,10, ve bağışıklama sonra fare sera farklı zaman noktalarda hasat 11.
ELISA yaygın ve Biyomedikal araştırma15,16analitik bir araç olarak tıpta bir tanı aracı olarak kullanıldığı plaka tabanlı bir tahlil olduğunu. Algılamak ve antikorlar, hormonlar, sitokinler, kemokinler ve çeşitli antijenleri, vbdahil olmak üzere analitler ölçmek için kullanılır. ELISA doğrudan, dolaylı, sandviç ve rekabetçi ELISA15,16da dahil olmak üzere, birkaç farklı biçimlerde gerçekleştirilebilir. Genel olarak, birincil bir antikor ile inkübe genellikle bir 96-şey microtiter plaka, sağlam bir yüzeye antijen immobilizasyon içerir. Kuluçka sonra ilişkisiz antikor yıkadı. Bir doğrudan ELISA, birincil antikor doğrudan hangi gibi bir sinyal algılama aracı tarafından algılanan bir görünür renk değişikliği vermeye chromogenic bir substrat ayırmak bir enzim için (genellikle horseradish peroksidaz veya alkalen fosfataz), Birleşik bir Spektrofotometre15,16. Bir enzim bağlı ikincil antikor birincil antikor bağlamak için kullanılan, buna ek olarak, o zaman bu bir dolaylı ELISA15,16kabul edilir. Dolaylı ELISA daha duyarlı15,16ise doğrudan ELISA daha hızlıdır. Bir sandviç ELISA, tabakları faiz örneklerde antijen hareketsiz için kullanılan bir “yakalama” antikor ile kaplı olan ve daha sonra yakalanan antijen bir doğrudan veya dolaylı şekilde15, başka bir “algılama” antikor tarafından tespit edilebilir 16. sandviç ELISA sunar yüksek özgüllük beri antijen iki farklı antikor-antijen tarafından algılanır. Rekabetçi bir ELISA, rekabet örnek antijen ve plaka bağlı antijen için birincil antikor bağlanma arasında kurulan ve örnek antijen konsantrasyonu substrat sinyalini azalma ölçerek sonra sayılabilir 15 , 16. rekabetçi ELISA yukarıda belirtilen doğrudan veya dolaylı biçim kullanılarak yapılır ve tek epitope15,16ile küçük antijenleri tespiti için yararlıdır.
Electrochemiluminescence (ECL) tahlil ve yüzey plasmon rezonans (SPR) tahlil17, antikorların ölçümü için alternatif teknikleri radyo-immunoassay (RIA) içerir. RIA ilk immunoassay yüksek özgüllük ve radiolabeled kimyasalları18,19kullanarak hassasiyeti ile bu önlemleri bir antijen (veya antikor) varlığını gelişmiş olmasıdır. Ancak, kaygılar radyoaktif toksisite, bertaraf maliyeti, raf ömrü ve radyoaktif malzeme ile çalışmak için özel lisans nedeniyle ELISA daha iyi bir ve20,21ortak için daha uygun bir teknik kullanır. ECL olduğunu hangi chemiluminescent reaksiyonlar istikrarlı öncüleri bir elektrot yüzeyinde büyük ölçüde reaktif türler oluşturmak için elektrik kullanarak başlatılır ve analitler miktarını ölçmek için kullanılan son derece hassas bir tahlil (antijenleri gibi veya antikorlar)22. Ancak, ECL özel bir araç gerektirir ve böylece kadar geniş ELISA23kullanılmaz. SPR olduğunu ligandlar bağlama ölçmek için kullanılan bir doğrudan tahlil (e.g., antikorlar) molekülleri immobilize (e.g., antijenleri) bir sensör üzerinde yüzey24chip. SPR etkileşimleri çok özellikle gerçek zamanlı olarak algılar ve ELISA olduğu gibi etiketli reaktifler kullanımını gerektirmez. Ancak, SPR Ayrıca özel bir ekipman gerektirir ve ELISA17daha düşük duyarlılık vardır. Alternatif yöntemleri kısıtlamaları göz önüne alındığında, ELISA amacımız bu iletişim kuralı için en uygun ve uygun teknik olduğunu. Burada, biz sandviç ELISA toplam Ig izotip düzeyleri Analizi ve antijen spesifik IG isotypes analizi için dolaylı ELISA işlemleri için nasıl kullanılacağını açıklar.
Burada, TD ve TI Ig izotip yanıt ELISA kullanarak farelerde karakterizasyonu için protokol açıklayın. Bu protokol başarılı uygulama ELISA tahlil tabaklar, bağışıklama Ags, fare Ig izotip özel antikorlar ve standartlar dahil olmak üzere Tablo 1‘ de belirtilen malzeme kullanımı gerektirir. Doku kültürü tedavi plakaları ELISA için kullanmamak için özen gösterilmelidir. Dilutions standartları ve serum numuneleri ayrı tedavi edilmezse levha (yuvarlak-alt) yapılır ve ELISA kalıplar…
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışmada sağlık hibe R01 CA158402 Ulusal Enstitüleri (s. Xie) tarafından desteklenen ve R21 AI128264 (s. Xie), Savunma Bakanlığı’nın izni W81XWH-13-1-0242 (s. Xie), bir Pilot Ödülü gelen Kanser Enstitüsü New Jersey Grant numarası P30CA072720 ile Ulusal Kanser Enstitüsü (s. Xie), Busch Biyomedikal Grant (s. Xie), Victor Stollar Bursu (A. Lalani) ve bir Anne B. ve James B. Leathem Bursu (S. Zhu).
VersaMax Tunable Microplate Reader | MDS Analytical Technologies | VERSAMAX | Equipment to read the plates |
SOFTmax PRO 5.3 | MDS Analytical Technologies | SOFTmax PRO 5.3 | Software for the plate reader |
GraphPad Prism | GraphPad | Prism | Software for graphing and statistics |
TNP-AECM-polysaccharide (FICOLL) | Biosearch Technologies | F-1300-10 | A TI Ag for immunization |
TNP-KLH | Biosearch Technologies | T-5060-5 | A TD Ag for immunization |
TNP(38)-BSA | Biosearch Technologies | T-5050-10 (conjugation ratio: 38) | Coating Ag for TNP-specific ELISA |
TNP(3)-BSA | Biosearch Technologies | T-5050-10 (conjugation ratio: 3) | Coating Ag for high affinity TNP-specific Ig |
Imject Alum | Fisher Scientific | PI-77161 | Alum adjuvant for immunization |
Falcon Polypropylene tubes | Fisher Scientific | 14-959-11A | For incubation of TNP-KLH/alum |
BD Insulin Syringe | Fisher Scientific | 14-829-1B | For i.p. injection of mice |
Immuno 96-Well Plates, Flat-Bottom | Fisher Scientific | 14-245-61 | For ELISA |
Untreated 96-Well Microplates, Round-Bottom | VWR | 82050-622 | For serial dilutions of standards and samples |
Phosphatase substrate, 5 mg Tablets | Sigma | S0942-200TAB | AP substrate |
Diethanolamine | VWR | IC15251690 | A component of AP substrate buffer |
Goat anti-mouse IgM | SouthernBiotech | 1020-01 | Capture Ab for mouse IgM |
Goat anti-mouse IgG1 | SouthernBiotech | 1070-01 | Capture Ab for mouse IgG1 |
Goat anti-mouse IgG2a | SouthernBiotech | 1080-01 | Capture Ab for mouse IgG2a |
Goat anti-mouse IgG2b | SouthernBiotech | 1090-01 | Capture Ab for mouse IgG2b |
Goat anti-mouse IgG3 | SouthernBiotech | 1100-01 | Capture Ab for mouse IgG3 |
Goat anti-mouse IgA | SouthernBiotech | 1040-01 | Capture Ab for mouse IgA |
Goat anti-mouse IgE | SouthernBiotech | 1110-01 | Capture Ab for mouse IgE |
AP-Goat anti-mouse IgM | SouthernBiotech | 1020-04 | Detection Ab for mouse IgM |
AP-Goat anti-mouse IgG1 | SouthernBiotech | 1070-04 | Detection Ab for mouse IgG1 |
AP-Goat anti-mouse IgG2a | SouthernBiotech | 1080-04 | Detection Ab for mouse IgG2a |
AP-Goat anti-mouse IgG2b | SouthernBiotech | 1090-04 | Detection Ab for mouse IgG2b |
AP-Goat anti-mouse IgG3 | SouthernBiotech | 1100-04 | Detection Ab for mouse IgG3 |
AP-Goat anti-mouse IgA | SouthernBiotech | 1040-04 | Detection Ab for mouse IgA |
AP-Goat anti-mouse IgE | SouthernBiotech | 1110-04 | Detection Ab for mouse IgE |
Mouse IgM standard | BD Biosciences | 553472 | TNP-specific IgM, Clone G155-228 |
Mouse IgG1 standard | BD Biosciences | 554054 | TNP-specific IgG1, Clone 107.3 |
Mouse IgG2a standard | BD Biosciences | 556651 | TNP-specific IgG2a, Clone G155-178 |
Mouse IgG2b standard | BD Biosciences | 554055 | TNP-specific IgG2b, Clone 49.2 |
Mouse IgG3 standard | BD Biosciences | 553486 | KLH-specific IgG3, Clone A112-3 |
Mouse IgA standard | BD Biosciences | 550924 | Mineral oil-induced IgA, Clone MOPC-320 |
Mouse IgE standard | BD Biosciences | 557079 | TNP-specific IgE, Clone C38-2 |