Summary

Caracterización de las respuestas de isotipo de inmunoglobulina dependiente del timo y timo-independiente en ratones usando el análisis enzima-ligado del inmunosorbente

Published: September 07, 2018
doi:

Summary

En este artículo se describe un protocolo para caracterizar las respuestas de isotipo de inmunoglobulina (Ig) T dependientes y T independientes en ratones usando ELISA. Este método se usa solo o en combinación con el flujo cytometry permitirá a los investigadores identificar las diferencias en las respuestas de isotipo de Ig mediada por células B en ratones después de la inmunización de antígenos T dependientes y T independientes.

Abstract

Anticuerpos, también llamados como distinguen de inmunoglobulinas (Ig), secretadas por los linfocitos B, células de plasma plasmablasts, en la inmunidad humoral proporcionan una formidable defensa contra la invasión de patógenos a través de diversos mecanismos. Un objetivo importante de la vacunación es inducir anticuerpos protectores específicos de antígeno para prevenir las infecciones mortales. Tanto timo dependiente (TD) y antígenos de timo-independientes (TI) pueden provocar respuestas de IgM específica de antígeno sólidas y también pueden inducir la producción de anticuerpos de isotipo-switched (IgG, IgA e IgE) así como la generación de células de memoria B con la ayuda proporcionado por el antígeno que presenta las células (APCs). Aquí, describimos un protocolo para caracterizar las respuestas del TD y TI Ig isotipo en ratones usando el análisis enzima-ligado del inmunosorbente (ELISA). En este protocolo, TD y TI Ig respuestas son sacadas en ratones por inmunización intraperitoneal (i.p.) con antígenos conjugado hapteno-modelo PNT-KLH (en alumbre) y PNT-polisacárido (PBS), respectivamente. Para inducir la respuesta de memoria TD, una inmunización de refuerzo de PNT-KLH en alumbre se da en 3 semanas después de la primera vacunación con el mismo antígeno/adyuvante. Suero de ratón es cosechada en diferentes puntos temporales antes y después de la inmunización. Total niveles de Ig y anticuerpos específicos a la PNT posteriormente se cuantifican utilizando Ig isotipo específica Sandwich y ELISA indirecto, respectivamente. Para cuantificar correctamente la concentración de suero de cada isotipo de Ig, las muestras deben diluirse adecuadamente para encajar dentro de la gama linear de las curvas estándar. Usando este protocolo, siempre hemos obtenido resultados confiables con sensibilidad y alta especificidad. Cuando se utiliza en combinación con otros métodos complementarios como la citometría de flujo, en vitro cultura de esplénico de células B e immunohistochemical tinción (IHC), este protocolo permitirá a los investigadores obtener una comprensión completa del anticuerpo respuestas en un entorno experimental dado.

Introduction

Los linfocitos B son el jugador principal en la inmunidad humoral y el único tipo de célula en mamíferos que son capaces de producir anticuerpos, denominados también como inmunoglobulinas (Ig)1,2. Anticuerpos secretados por las células de B proporcionan una defensa formidable contra los invasores patógenos a través de diversos mecanismos incluyendo la opsonización, neutralización y activación del complemento, conduciendo a inmunidad protectora3. Secreción de anticuerpos por las células B se logra después de la completa activación de células B específicas, que normalmente requiere que dos distintas señales3. Señal 1 es retransmitida por atascamiento directo del antígeno (Ag) al receptor de células B (BCR) expresado en la superficie de ingenuo específico B células3. Dependiendo de la fuente de señal 2, activación de la célula de B puede dividirse en timo dependiente (TD) o timo-independientes (TI)3,4. En una respuesta de antígeno TD, 2 señal es proporcionada por cognado T CD4 helper (TH) las células activadas, que expresan CD154, el ligando para el receptor coestimuladoras CD40 expresado en las células de B1,2,3. En una respuesta antígeno TI señal 2 viene de cualquier participación de receptores Toll-like (TLRs en el caso del tipo 1 TI Ag) o Cross-linking extenso de las BCRs (en el caso del tipo 2 TI Ag) en la B células3,4. Antígenos de TI (TI-1) de tipo 1 son ligandos microbianos de TLRs, incluyendo lipopolisacáridos bacterianos (LPS), RNAs virales y CpG de ADN microbiano4,5. Tipo 2 TI (TI-2) antígenos tienen estructura altamente repetitiva y son capaces de entregar prolongada y persistente de señalización a la célula de B por varios Cross-linking de la BCRs4,6. Típicos los antígenos TI-2 ejemplos de polisacáridos de neumococos y polisacárido conjugado hapteno-6,7. Antígenos de TD y TI pueden provocar respuestas de IgM específica de antígeno sólidas y también pueden inducir la producción de anticuerpos de isotipo-switched (IgG, IgA e IgE) con la ayuda brindada por el antígeno que presenta las células (APCs), como las células dendríticas (DCs)1 ,2,3. Además, TD y TI antígenos son capaces de inducir respuestas de memoria con la ayuda de APC, pero TD antígenos son más eficientes en la inducción de memoria células B generación3,8.

En este protocolo, TD y TI Ig respuestas son sacadas en ratones por la inmunización intraperitoneal (i.p.) con hemocianina de Lapa 2,4,6-trinitrophenyl-cerradura modelo hapteno conjugado antígenos (PNT-KLH) y PNT-polisacárido (neutro, muy ramificado y la Misa), respectivamente9,10,11. Antígenos de TD se utilizan generalmente con un adyuvante para mejorar la producción de anticuerpos12. Aquí en nuestro protocolo, PNT-KLH se inyecta con el alumbre, un coadyuvante utilizado en estudios de inmunización12. Otros ejemplos de aditivos que pueden utilizarse son completo o incompleto adyuvante de Freund (CFA o IFA), monophosphoryl-lípido A / dicorynomycolate de trehalosa (adyuvante de “Ribi del”) y oligodeoxynucleotides de CpG, etc.13, 14. después de la inmunización, sueros de ratón son cosechados en diferentes puntos temporales y anticuerpos de PNT específicos en el suero se cuantifican utilizando Ig isotipo específica enzima-ligado del inmunosorbente (ELISA) de ensayo9,10, 11.

ELISA es un ensayo basado en la placa que es ampliamente utilizado como una herramienta de diagnóstico en medicina y también como una herramienta de análisis en investigación biomédica15,16. Se utiliza para detectar y cuantificar analitos como anticuerpos, hormonas, citoquinas, quimiocinas y varios antígenos, etcetera. ELISA se puede realizar en varios formatos diferentes, incluyendo directo, indirecto, sandwich y competitivo ELISA15,16. En general, implica la inmovilización del antígeno en una superficie sólida, generalmente una placa de microtitulación de 96 pocillos, que se incuba con un anticuerpo primario. Después de la incubación, el anticuerpo no Unido se lava lejos. En un ELISA directo, el anticuerpo primario directamente se conjuga a una enzima (generalmente la peroxidasa de rábano o fosfatasa alcalina), que puede unirse un sustrato cromogénico para producir un cambio de color visible detectado por un instrumento de detección de señal como un Espectrofotómetro15,16. Por el contrario, si un anticuerpo enzima-ligado del secundario se utiliza para enlazar el anticuerpo primario, entonces esto se considera como un indirecto ELISA15,16. ELISA directo es más rápido mientras que ELISA indirecta es más sensible15,16. En un sandwich ELISA, las placas están recubiertas con un anticuerpo de la «captura» utilizado para inmovilizar el antígeno de interés en las muestras, y luego puede detectarse el antígeno capturado por otro anticuerpo de la “detección” de una manera directa o indirecta15, 16. ELISA Sandwich ofrece alta especificidad ya que el antígeno es detectado por dos diversos anticuerpos del antígeno. En un ELISA competitivo, la competencia se establece entre el antígeno de la muestra y el antígeno de limite de placa de unión del anticuerpo primario, y entonces la concentración de antígeno en la muestra se cuantifica midiendo la reducción de señal del substrato 15 , 16. ELISA competitivo puede realizarse utilizando el formato mencionado directo o indirecto y es útil para la detección de antígenos pequeños con un único epitopo15,16.

Técnicas alternativas para la medición de anticuerpos incluyen radio-inmunoanálisis (RIA), electrochemiluminescence (ECL) ensayo y superficie de resonancia de plasmon (SPR) ensayo17. RIA fue el primer inmunoensayo desarrollado que medidas la presencia de un antígeno (o anticuerpos) de alta especificidad y sensibilidad usando reactivos radiactivos18,19. Sin embargo, debido a las preocupaciones de toxicidad radioactiva, sus costes de eliminación, vida útil y licencias especiales para trabajar con materiales radioactivos, ELISA es la mejor y más conveniente técnica común utiliza20,21. ECL es un ensayo altamente sensible que reacciones de quimioluminiscencia se inician usando electricidad para generar especies altamente reactivas a partir de precursores estables en la superficie de un electrodo y pueden ser utilizadas para medir la cantidad de analitos (como antígenos o anticuerpos)22. Sin embargo, ECL requiere un instrumento especial y por lo tanto no es tan ampliamente usado como ELISA23. SPR es un ensayo directo que puede utilizarse para medir la Unión de ligandos (por ej., anticuerpos) para inmovilizar moléculas (e.g., antígenos) en un sensor chip superficial24. SPR detecta las interacciones en tiempo real muy concreto y no requiere el uso de reactivos etiquetados como ELISA. Sin embargo, el SPR también requiere un equipo especial y tiene menor sensibilidad que el ELISA17. Dadas las limitaciones de los métodos alternativos, ELISA es la técnica más adecuada y conveniente para nuestro propósito en este protocolo. Aquí, describimos el uso de sandwich ELISA para el análisis de los niveles totales de isotipo de Ig y los procedimientos de ELISA indirecto para el análisis de los isotipos de Ig específica de antígeno.

Protocol

Este protocolo sigue las directrices del Comité de ética institucional de investigación animal de la Universidad de Rutgers. Todos los ratones se utilizan con arreglo a las directrices de los NIH y bajo un protocolo animal aprobado por la institucional Animal cuidado y uso. 1. preparación de ratones y recogida de sueros de ingenuo ratón Mantenga todos los ratones para los experimentos de inmunización en un específico Animalario libre de patógenos. Nocaut de sexo-emp…

Representative Results

Hemos utilizado este protocolo para investigar las funciones de un regulador crítico del sistema inmune, TRAF3, TI y TD Ig isotipo respuestas9,10,11. TRAF3 directa o indirectamente regula la transducción de la señal de un número de receptores inmunes innatos y adaptativos, incluyendo la superfamilia de receptores TNF, receptores Toll-like y T de la célula del receptor/CD28, entre otros<sup c…

Discussion

Aquí, describimos el protocolo para la caracterización de las respuestas del TD y TI Ig isotipo en ratones usando ELISA. Exitosa implementación de este protocolo requiere el uso de materiales especificados en la tabla 1, incluyendo placas de ensayo ELISA, inmunización Ags, anticuerpos de isotipo-específicos de Ig de ratón y las normas. Debe tener cuidado de evitar el uso de las placas de cultivo de tejidos tratado para ELISA. Diluciones de los estándares y las muestras de suero deben ser en placas…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este estudio fue apoyado por los institutos nacionales de becas en salud CA158402 R01 (P. Xie) y R21 AI128264 (P. Xie), el Ministerio de defensa conceder W81XWH-13-1-0242 (P. Xie), un premio de piloto del cáncer Institute de New Jersey a través de la concesión número P30CA072720 del Instituto Nacional del cáncer (P. Xie), una subvención Biomédica de Busch (P. Xie), una beca Stollar Victor (Lalani a.) y Anne B. y James B. Leathem beca (S. Zhu).

Materials

VersaMax Tunable Microplate Reader MDS Analytical Technologies VERSAMAX Equipment to read the plates
SOFTmax PRO 5.3 MDS Analytical Technologies SOFTmax PRO 5.3 Software for the plate reader
GraphPad Prism GraphPad Prism Software for graphing and statistics
TNP-AECM-polysaccharide (FICOLL) Biosearch Technologies F-1300-10 A TI Ag for immunization
TNP-KLH Biosearch Technologies T-5060-5 A TD Ag for immunization
TNP(38)-BSA Biosearch Technologies T-5050-10 (conjugation ratio: 38) Coating Ag for TNP-specific ELISA
TNP(3)-BSA Biosearch Technologies T-5050-10 (conjugation ratio: 3) Coating Ag for high affinity TNP-specific Ig
Imject Alum Fisher Scientific  PI-77161 Alum adjuvant for immunization
Falcon Polypropylene tubes Fisher Scientific  14-959-11A For incubation of TNP-KLH/alum
BD Insulin Syringe Fisher Scientific  14-829-1B For i.p. injection of mice
Immuno 96-Well Plates, Flat-Bottom Fisher Scientific  14-245-61 For ELISA
Untreated 96-Well Microplates, Round-Bottom VWR 82050-622 For serial dilutions of standards and samples
Phosphatase substrate, 5 mg Tablets Sigma S0942-200TAB AP substrate
Diethanolamine VWR IC15251690 A component of AP substrate buffer
Goat anti-mouse IgM SouthernBiotech 1020-01 Capture Ab for mouse IgM
Goat anti-mouse IgG1 SouthernBiotech 1070-01 Capture Ab for mouse IgG1
Goat anti-mouse IgG2a SouthernBiotech 1080-01 Capture Ab for mouse IgG2a
Goat anti-mouse IgG2b SouthernBiotech 1090-01 Capture Ab for mouse IgG2b
Goat anti-mouse IgG3 SouthernBiotech 1100-01 Capture Ab for mouse IgG3
Goat anti-mouse IgA SouthernBiotech 1040-01 Capture Ab for mouse IgA
Goat anti-mouse IgE SouthernBiotech 1110-01 Capture Ab for mouse IgE
AP-Goat anti-mouse IgM SouthernBiotech 1020-04 Detection Ab for mouse IgM
AP-Goat anti-mouse IgG1 SouthernBiotech 1070-04 Detection Ab for mouse IgG1
AP-Goat anti-mouse IgG2a SouthernBiotech 1080-04 Detection Ab for mouse IgG2a
AP-Goat anti-mouse IgG2b SouthernBiotech 1090-04 Detection Ab for mouse IgG2b
AP-Goat anti-mouse IgG3 SouthernBiotech 1100-04 Detection Ab for mouse IgG3
AP-Goat anti-mouse IgA SouthernBiotech 1040-04 Detection Ab for mouse IgA
AP-Goat anti-mouse IgE SouthernBiotech 1110-04 Detection Ab for mouse IgE
Mouse IgM standard BD Biosciences 553472 TNP-specific IgM, Clone  G155-228
Mouse IgG1 standard BD Biosciences 554054 TNP-specific IgG1, Clone  107.3
Mouse IgG2a standard BD Biosciences 556651 TNP-specific IgG2a, Clone  G155-178
Mouse IgG2b standard BD Biosciences 554055 TNP-specific IgG2b, Clone  49.2
Mouse IgG3 standard BD Biosciences 553486 KLH-specific IgG3, Clone  A112-3
Mouse IgA standard BD Biosciences 550924 Mineral oil-induced IgA, Clone  MOPC-320
Mouse IgE standard BD Biosciences 557079 TNP-specific IgE, Clone  C38-2

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Lalani, A. I., Zhu, S., Xie, P. Characterization of Thymus-dependent and Thymus-independent Immunoglobulin Isotype Responses in Mice Using Enzyme-linked Immunosorbent Assay. J. Vis. Exp. (139), e57843, doi:10.3791/57843 (2018).

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