Summary

Charakterisierung der Thymus-abhängig und Thymus-unabhängige Immunglobulin Isotype Antworten bei Mäusen mit Enzym-linked Immunosorbentprobe Assay

Published: September 07, 2018
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Summary

In diesem Artikel beschreiben wir ein Protokoll zur Charakterisierung von T-abhängigen und T-unabhängige Immunglobulin (Ig) Isotype Antworten bei Mäusen mittels ELISA. Diese Methode verwendet, allein oder in Kombination mit Flow Cytometry wird erlauben Forschern, Unterschiede in der B-Zell-vermittelten Ig Isotype Antworten bei Mäusen nach T-abhängigen und T-unabhängige Antigen-Immunisierung zu identifizieren.

Abstract

Antikörper, auch bezeichnet als Immunglobuline (Ig), abgesondert von B-Lymphozyten, Plasmablasts/Plasmazellen im humorale Immunität unterschieden bieten eine gewaltige Verteidigung gegen eindringende Krankheitserreger über vielfältige Mechanismen. Ein wichtiges Ziel der Impfung ist, schützende Antigen-spezifische Antikörper, lebensbedrohliche Infektionen zu verhindern. Thymus-abhängig (TD) und Thymus-unabhängige (TI) Antigene robuste Antigen-spezifische IgM Antworten entlocken können und können auch induzieren die Produktion von Isotype geschalteten Antikörpern (IgG, IgA und IgE) sowie die Generierung von Speicherzellen B mit Hilfe durch antigenpräsentierende Zellen (APCs) bereitgestellt. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Charakterisierung von TD und TI Ig Isotype Reaktionen bei Mäusen mit Enzym-linked Immunosorbentprobe Assay (ELISA). In diesem Protokoll sind TD und TI Ig Antworten durch intraperitoneale (i.p.) Immunisierung mit konjugierten Hapten Modell Antigene TNP-KLH (in Alaun) und TNP-Polysaccharid (mit PBS-Puffer), bzw. in den Mäusen ausgelöst. Um TD Speicher Reaktion hervorzurufen, ist eine Auffrischimpfung von TNP-KLH in Alaun 3 Wochen nach der ersten Impfung mit dem gleichen Antigen/adjuvante gegeben. Maus-Seren werden zu verschiedenen Zeitpunkten vor und nach der Immunisierung geerntet. Insgesamt Ig Serumspiegel und TNP-spezifische Antikörper sind anschließend quantifiziert mit Ig Isotype-spezifische Sandwich und indirekten ELISA, beziehungsweise. Um die Serumkonzentration von jedem Ig Isotype korrekt zu quantifizieren, müssen die Proben entsprechend verdünnt werden, um innerhalb des linearen Bereichs der standard Kurven passen. Unter Verwendung dieses Protokolls, haben wir konsequent zuverlässige Ergebnisse mit hoher Spezifität und Sensitivität erreicht. Bei Verwendung in Kombination mit anderen ergänzenden Methoden wie Durchflusszytometrie, in-vitro- Kultur der Milz B-Zellen und immunhistochemische können Färbung (IHC), dieses Protokoll Forscher, ein umfassendes Verständnis des Antikörpers zu gewinnen Antworten in einer bestimmten experimentellen Einstellung.

Introduction

B-Lymphozyten sind der Hauptakteur in humorale Immunität und die einzige Zelltyp bei Säugetieren, die in der Lage, die Produktion von Antikörpern, auch als Immunglobuline (Ig)1,2bezeichnet sind. Abgesondert von B-Zellen Antikörper bieten eine gewaltige Verteidigung gegen eindringende Krankheitserreger über vielfältige Mechanismen, einschließlich Neutralisation, Opsonization und Komplementaktivierung führt zu schützende Immunität3. Sekretion von Antikörpern durch B-Zellen wird erst nach der vollständigen Aktivierung von bestimmten B-Zellen, die erfordert in der Regel zwei unterschiedliche Signale,3erreicht. Signal 1 wird durch die direkte Bindung des Antigens (Ag) an den B-Zell-Rezeptor (BCR) ausgedrückt auf der Oberfläche von bestimmten naive B Zellen3weitergeleitet. Abhängig von der Quelle des Signals 2 kann Thymus-abhängig (TD) oder Thymus-unabhängige (TI)3,4B-Zell-Aktivierung unterteilt werden. Ein TD-Antigen-Reaktion liefert Signal 2 aktivierten cognate CD4 T (TH)-Helferzellen, die CD154, die Liganden für den co-stimulatory-Rezeptor CD40 ausgedrückt auf B Zellen1,2,3zum Ausdruck bringen. Ein TI-Antigen-Reaktion, Signal 2 entstammt entweder Engagement von Toll-Like-Rezeptoren (TLRs bei Typ 1 TI-Ag) oder umfangreiche Vernetzung der BCR (bei Typ-2 TI Ag) auf der B-Zellen3,4. Typ 1 TI (TI-1) Antigene sind mikrobielle Liganden der TLRs, einschließlich der bakteriellen Lipopolysacchariden (LPS), virale RNA und mikrobielle CpG-DNA4,5. Typ 2 TI (TI-2) Antigene haben stark repetitiven Struktur und liefern längere und anhaltende Signalisierung zu B-Zellen durch mehrere Vernetzung der BCR4,6. Typische Beispiele für TI-2-Antigene sind Pneumokokken Polysaccharide und Hapten konjugierte Polysaccharid-6,7. TD und TI Antigene können robuste Antigen-spezifische IgM Antworten entlocken und induzieren können auch die Produktion von Isotype geschalteten Antikörpern (IgG, IgA und IgE) mit der Hilfe von antigenpräsentierende Zellen (APCs) wie Dendritische Zellen (DCs)1 ,2,3. Darüber hinaus TD und TI Antigene sind in der Lage, Speicher-Reaktionen mit Hilfe von APCs induzieren, aber TD Antigene sind effizienter, induzierende Speicher B-Zell-Generation3,8.

In diesem Protokoll sind TD und TI Ig Antworten bei Mäusen durch intraperitoneale (i.p.) Immunisierung mit Hapten konjugiert Modell Antigene 2,4,6-Trinitrophenyl-Keyhole Limpet Hemocyanin (TNP-KLH) und TNP-Polysaccharid (Neutral, stark verzweigte ausgelöst. und hoher Masse), bzw.9,10,11. TD Antigene sind in der Regel mit Adjuvans zur die Produktion von Antikörpern12zu erhöhen. Hier in unserem Protokoll TNP-KLH mit Alaun, eine häufig verwendete adjuvante Impfung Studien12injiziert. Andere Beispiele für Hilfsstoffe, die verwendet werden können vollständig oder unvollständig Freund des Adjuvans (CFA oder IFA), Monophosphoryl-Lipid A / Trehalose Dicorynomycolate (“Ribi” adjuvante) und CpG oligodeoxynukleotiden, etc.13, 14. nach der Immunisierung, Maus Sera werden zu verschiedenen Zeitpunkten geerntet und TNP-spezifischen Antikörper im Serum quantifiziert mit Ig Isotype-spezifischen Enzym-linked Immunosorbentprobe Assay (ELISA)9,10, 11.

ELISA ist ein Teller-basierte Assay, der weithin als Diagnosewerkzeug in der Medizin und auch als analytisches Werkzeug in der biomedizinischen Forschung15,16verwendet wird. Es dient zum erkennen und quantifizieren Analyten einschließlich Antikörper, Hormone, Zytokine, Chemokine, und verschiedene Antigene, etc.. ELISA kann in verschiedenen Formaten, einschließlich direkte, indirekte, Sandwich und wettbewerbsfähigen ELISA15,16durchgeführt werden. Im Allgemeinen geht es um die Immobilisierung des Antigens an einer festen Oberfläche, in der Regel einer 96-Well Mikrotiterplatte, die mit einem primären Antikörper inkubiert. Nach der Inkubation wird die ungebundene Antikörper abgewaschen. In eine direkte ELISA der primäre Antikörper direkt mit einem Enzym (in der Regel Meerrettich Peroxidase oder alkalische Phosphatase), die einem chromogenen Substrat um einen sichtbaren Farbumschlag erkannt durch ein Signal-Erkennung-Instrument wie Ausbeute Spalten kann konjugiert ist ein Spektralphotometer15,16. Im Gegensatz dazu, wenn ein Enzym-linked Sekundärantikörper verwendet wird, um den primären Antikörper binden, dann gilt dies als eine indirekte ELISA15,16. Direkte ELISA ist schneller während indirekte ELISA empfindlicher15,16. In einem Sandwich ELISA die Platten sind mit einem “einfangen” Antikörper verwendet, um das Antigen des Interesses an den Proben zu immobilisieren beschichtet, und dann das aufgenommene Antigen erkannt werden, von einem anderen “detektionsantikörper” in eine direkte oder indirekte Weise15, 16. Sandwich ELISA bietet hohen Spezifität, da das Antigen durch zwei verschiedene Antikörper an das Antigen erkannt wird. In einem wettbewerbsfähigen ELISA die Konkurrenz zwischen Probe Antigen und die Platte gebundene Antigen für die Bindung an den Primärantikörper ansässig ist, und dann die Antigenkonzentration in der Probe wird durch die Messung des Rückgang der Signal vom Substrat quantifiziert 15 , 16. wettbewerbsfähige ELISA durchgeführt werden kann, mit dem oben genannten direkten oder indirekten-Format und eignet sich für die Erkennung von kleinen Antigene mit nur ein Epitop15,16.

Alternative Verfahren zur Messung der Antikörper gehören Radio-Immunoassay (RIA), Electrochemiluminescence (ECL) Assay und Surface Plasmon Resonance (SPR) assay17. RIA war, dass die ersten Immunoassay entwickelt, dass die Maßnahmen die Anwesenheit eines Antigens (oder Antikörper) mit hoher Spezifität und Sensitivität mit radioaktiven Reagenzien18,19. Jedoch, aufgrund von Bedenken der radioaktiven Toxizität, Entsorgungskosten, Haltbarkeit und spezielle Lizenzen mit radioaktiven Stoffen zu arbeiten, ELISA ist eine bessere und bequemere Technik für gemeinsame nutzt20,21. ECL ist ein hochsensibler Assay in der Chemilumineszenz-Reaktionen werden initiiert, unter Verwendung der Elektrizität, um hoch reaktive Spezies aus stabilen Vorstufen auf der Oberfläche der Elektrode zu generieren, und können verwendet werden, um die Menge des Analyten zu messen (z. B. Antigene oder Antikörper)22. Allerdings erfordert ein spezielles Instrument ECL und somit nicht so breit als ELISA23eingesetzt. SPR ist ein direkter Assay, die verwendet werden kann, um die Bindung des Liganden zu messen (zB., Antikörper), immobilisiert Moleküle (zB., Antigene) auf einem Sensor chip-Oberfläche24. SPR erkennt die Interaktionen in Echtzeit sehr spezifisch und erfordert nicht die Verwendung von markierten Reagenzien wie ELISA. Allerdings erfordert eine spezielle Ausrüstung SPR auch und hat eine geringeren Empfindlichkeit als ELISA17. Angesichts der Einschränkungen der alternativen Methoden, ist ELISA die am besten geeignete und günstige Technik für unsere Zwecke in diesem Protokoll. Hier beschreiben wir die Verwendung von Sandwich ELISA für die Analyse der gesamten Ig Isotype Ebenen und das Verfahren der indirekten ELISA für die Analyse der Antigen-spezifische Ig Klassen.

Protocol

Dieses Protokoll folgt den Richtlinien des institutionellen Tierforschung Ethik-Kommission der Rutgers University. Alle Mäuse dienen nach NIH-Richtlinien und eine tierische Protokolls durch die institutionelle Animal Care and Use Committee genehmigt. 1. Vorbereitung von Mäusen und Sammlung von naiven Maus Sera Halten Sie alle Mäuse für Immunisierung Experimente in einem bestimmten Pathogen-freies Tierhaus. Mäuse, die die gleichen Eltern und Käfige für Immunisierung S…

Representative Results

Wir haben dieses Protokoll verwendet, um die Rollen von einem kritischen Regler des immunen Systems, TRAF3, TI und TD Ig Isotype Antworten9,10,11zu untersuchen. TRAF3 direkt oder indirekt regelt die Signaltransduktion eine Reihe von angeborenen und der adaptiven Immunsystems Rezeptoren, einschließlich der TNF-Rezeptor-Superfamilie, Toll-Like-Rezeptoren und T-Zell-Rezeptor/CD28, unter anderem<sup…

Discussion

Hier beschreiben wir das Protokoll für die Charakterisierung von TD und TI Ig Isotype Reaktionen bei Mäusen mittels ELISA. Erfolgreiche Umsetzung dieses Protokolls erfordert die Verwendung von Materialien, die in Tabelle 1, einschließlich ELISA-Assay-Platten, Immunisierung Ags, Maus Ig Isotype-spezifische Antikörper und Normen angegeben. Darauf sollte geachtet werden, vermeiden die Verwendung von Gewebekultur behandelt Platten für ELISA. Verdünnungen der Standards und Serumproben sollten in separat…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Studie wurde unterstützt von den National Institutes of Health Zuschüsse R01 CA158402 (P. xxx) und R21 AI128264 (P. Xie), dem Department of Defense gewähren W81XWH-13-1-0242 (s. Xie), ein Pilot Award vom Cancer Institute of New Jersey durch Grant Nummer P30CA072720 vom National Cancer Institute (s. xxx), ein Busch biomedizinische Grant (s. xxx), Victor Stollar Stipendiat (A. Lalani) und Anne B. und James B. Leathem Fellowship (S. Zhu).

Materials

VersaMax Tunable Microplate Reader MDS Analytical Technologies VERSAMAX Equipment to read the plates
SOFTmax PRO 5.3 MDS Analytical Technologies SOFTmax PRO 5.3 Software for the plate reader
GraphPad Prism GraphPad Prism Software for graphing and statistics
TNP-AECM-polysaccharide (FICOLL) Biosearch Technologies F-1300-10 A TI Ag for immunization
TNP-KLH Biosearch Technologies T-5060-5 A TD Ag for immunization
TNP(38)-BSA Biosearch Technologies T-5050-10 (conjugation ratio: 38) Coating Ag for TNP-specific ELISA
TNP(3)-BSA Biosearch Technologies T-5050-10 (conjugation ratio: 3) Coating Ag for high affinity TNP-specific Ig
Imject Alum Fisher Scientific  PI-77161 Alum adjuvant for immunization
Falcon Polypropylene tubes Fisher Scientific  14-959-11A For incubation of TNP-KLH/alum
BD Insulin Syringe Fisher Scientific  14-829-1B For i.p. injection of mice
Immuno 96-Well Plates, Flat-Bottom Fisher Scientific  14-245-61 For ELISA
Untreated 96-Well Microplates, Round-Bottom VWR 82050-622 For serial dilutions of standards and samples
Phosphatase substrate, 5 mg Tablets Sigma S0942-200TAB AP substrate
Diethanolamine VWR IC15251690 A component of AP substrate buffer
Goat anti-mouse IgM SouthernBiotech 1020-01 Capture Ab for mouse IgM
Goat anti-mouse IgG1 SouthernBiotech 1070-01 Capture Ab for mouse IgG1
Goat anti-mouse IgG2a SouthernBiotech 1080-01 Capture Ab for mouse IgG2a
Goat anti-mouse IgG2b SouthernBiotech 1090-01 Capture Ab for mouse IgG2b
Goat anti-mouse IgG3 SouthernBiotech 1100-01 Capture Ab for mouse IgG3
Goat anti-mouse IgA SouthernBiotech 1040-01 Capture Ab for mouse IgA
Goat anti-mouse IgE SouthernBiotech 1110-01 Capture Ab for mouse IgE
AP-Goat anti-mouse IgM SouthernBiotech 1020-04 Detection Ab for mouse IgM
AP-Goat anti-mouse IgG1 SouthernBiotech 1070-04 Detection Ab for mouse IgG1
AP-Goat anti-mouse IgG2a SouthernBiotech 1080-04 Detection Ab for mouse IgG2a
AP-Goat anti-mouse IgG2b SouthernBiotech 1090-04 Detection Ab for mouse IgG2b
AP-Goat anti-mouse IgG3 SouthernBiotech 1100-04 Detection Ab for mouse IgG3
AP-Goat anti-mouse IgA SouthernBiotech 1040-04 Detection Ab for mouse IgA
AP-Goat anti-mouse IgE SouthernBiotech 1110-04 Detection Ab for mouse IgE
Mouse IgM standard BD Biosciences 553472 TNP-specific IgM, Clone  G155-228
Mouse IgG1 standard BD Biosciences 554054 TNP-specific IgG1, Clone  107.3
Mouse IgG2a standard BD Biosciences 556651 TNP-specific IgG2a, Clone  G155-178
Mouse IgG2b standard BD Biosciences 554055 TNP-specific IgG2b, Clone  49.2
Mouse IgG3 standard BD Biosciences 553486 KLH-specific IgG3, Clone  A112-3
Mouse IgA standard BD Biosciences 550924 Mineral oil-induced IgA, Clone  MOPC-320
Mouse IgE standard BD Biosciences 557079 TNP-specific IgE, Clone  C38-2

References

  1. Moise, A., Nedelcu, F. D., Toader, M. A., Sora, S. M., Tica, A., Ferastraoaru, D. E., Constantinescu, I. Primary immunodeficiencies of the B lymphocyte. Journal of Medicine and Life. 3, 60-63 (2010).
  2. Bishop, G. A., Haxhinasto, S. A., Stunz, L. L., Hostager, B. S. Antigen-specific B-lymphocyte activation. Critical Reviews in Immunology. 23, 149-197 (2003).
  3. Murphy, K. . Janeway’s Immunobiology. 8th Edition. 1, (2012).
  4. Vinuesa, C. G., Chang, P. P. Innate B cell helpers reveal novel types of antibody responses. Nature Immunology. 14, 119-126 (2013).
  5. Bekeredjian-Ding, I., Jego, G. Toll-like receptors–sentries in the B-cell response. Immunology. 128, 311-323 (2009).
  6. Mond, J. J., Lees, A., Snapper, C. M. T cell-independent antigens type 2. Annual Review of Immunology. 13, 655-692 (1995).
  7. Garcia de Vinuesa, C., O’Leary, P., Sze, D. M., Toellner, K. M., MacLennan, I. C. T-independent type 2 antigens induce B cell proliferation in multiple splenic sites, but exponential growth is confined to extrafollicular foci. European Journal of Immunology. 29, 1314-1323 (1999).
  8. Kurosaki, T., Kometani, K., Ise, W. Memory B cells. Nature Reviews Immunology. 15, 149-159 (2015).
  9. Xie, P., Stunz, L. L., Larison, K. D., Yang, B., Bishop, G. A. Tumor necrosis factor receptor-associated factor 3 is a critical regulator of B cell homeostasis in secondary lymphoid organs. Immunity. 27, 253-267 (2007).
  10. Xie, P., Kraus, Z. J., Stunz, L. L., Liu, Y., Bishop, G. A. TNF Receptor-Associated Factor 3 Is Required for T Cell-Mediated Immunity and TCR/CD28 Signaling. The Journal of Immunology. 186, 143-155 (2011).
  11. Lalani, A. I., Moore, C. R., Luo, C., Kreider, B. Z., Liu, Y., Morse, H. C., Xie, P. Myeloid Cell TRAF3 Regulates Immune Responses and Inhibits Inflammation and Tumor Development in Mice. The Journal of Immunology. 194, 334-348 (2015).
  12. Lee, S., Nguyen, M. T. Recent advances of vaccine adjuvants for infectious diseases. Immune Network. 15, 51-57 (2015).
  13. Gavin, A. L., Hoebe, K., Duong, B., Ota, T., Martin, C., Beutler, B., Nemazee, D. Adjuvant-enhanced antibody responses in the absence of toll-like receptor signaling. Science. 314, 1936-1938 (2006).
  14. Klinman, D. M., Currie, D., Gursel, I., Verthelyi, D. Use of CpG oligodeoxynucleotides as immune adjuvants. Immunological Reviews. 199, 201-216 (2004).
  15. Gan, S. D., Patel, K. R. Enzyme immunoassay and enzyme-linked immunosorbent assay. Journal of Investigative Dermatology. 133, 12 (2013).
  16. Shah, K., Maghsoudlou, P. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA): the basics. British Journal of Hospital Medicine. 77, 98-101 (2016).
  17. Nencini, F., Pratesi, S., Petroni, G., Matucci, A., Maggi, E., Vultaggio, A. Assays and strategies for immunogenicity assessment of biological agents. Drug Development Research. 75, 4-6 (2014).
  18. Haber, E., Page, L. B., Richards, F. F. Radio immunoassay employing gel filtration. Analytical Biochemistry. 12, 163-172 (1965).
  19. Yalow, R. S., Berson, S. A. Immunoassay of endogenous plasma insulin in man. 1960. Obesity Research. 4, 583-600 (1996).
  20. Lequin, R. M. Enzyme immunoassay (EIA)/enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Clinical Chemistry. 51, 2415-2418 (2005).
  21. Wreghitt, T. G., Tedder, R. S., Nagington, J., Ferns, R. B. Antibody assays for varicella-zoster virus: comparison of competitive enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), competitive radioimmunoassay (RIA), complement fixation, and indirect immunofluorescence assays. Journal of Medical Virology. 13, 361-370 (1984).
  22. Mathew, B. C., Biju, R. S., Thapalia, N. An overview of electrochemiluminescent (ECL) technology in laboratory investigations. Kathmandu University Medical Journal. 3, 91-93 (2005).
  23. Mikulskis, A., Yeung, D., Subramanyam, M., Amaravadi, L. Solution ELISA as a platform of choice for development of robust, drug tolerant immunogenicity assays in support of drug development. The Journal of Immunological Methods. 365, 38-49 (2011).
  24. Wadhwa, M., Bird, C., Dilger, P., Gaines-Das, R., Thorpe, R. Strategies for detection, measurement and characterization of unwanted antibodies induced by therapeutic biologicals. The Journal of Immunological Methods. 278, 1-17 (2003).
  25. Wolforth, J. B. Methods of Blood Collection in the Mouse. Laboratory Animals. 29, 47-53 (2000).
  26. Stunz, L. L., Busch, L. K., Munroe, M. E., Sigmund, C. D., Tygrett, L. T., Waldschmidt, T. J., Bishop, G. A. Expression of the Cytoplasmic Tail of LMP1 in Mice Induces Hyperactivation of B Lymphocytes and Disordered Lymphoid Architecture. Immunity. 21, 255-266 (2004).
  27. Xie, P. TRAF molecules in cell signaling and in human diseases. Journal of Molecular Signaling. 8, 7 (2013).
  28. Lalani, A. I., Zhu, S., Gokhale, S., Jin, J., Xie, P. TRAF molecules in inflammation and inflammatory diseases. Current Pharmacology Reports. 4, 64-90 (2018).
  29. Tate, J., Ward, G. Interferences in immunoassay. The Clinical Biochemist Reviews. 25, 105-120 (2004).
  30. Specter, S., Friedman, H. Age- and sex-related differences in antibody formation and blastogenic responsiveness of splenocytes from RIII mice developing virus-induced mammary adenocarcinoma. The Journal of the National Cancer Institute. 67, 1347-1351 (1981).
  31. Giefing-Kroll, C., Berger, P., Lepperdinger, G., Grubeck-Loebenstein, B. How sex and age affect immune responses, susceptibility to infections, and response to vaccination. Aging Cell. 14, 309-321 (2015).
  32. Kaminski, D. A., Stavnezer, J. Antibody class switching differs among SJL, C57BL/6 and 129 mice. International Immunology. 19, 545-556 (2007).
  33. Sellers, R. S., Clifford, C. B., Treuting, P. M., Brayton, C. Immunological variation between inbred laboratory mouse strains: points to consider in phenotyping genetically immunomodified mice. Veterinary Pathology. 49, 32-43 (2012).
  34. Conour, L. A., Murray, K. A., Brown, M. J. Preparation of animals for research–issues to consider for rodents and rabbits. Institute of Laboratory Animal Resources Journal. 47, 283-293 (2006).
  35. Vlkova, M., Rohousova, I., Hostomska, J., Pohankova, L., Zidkova, L., Drahota, J., Valenzuela, J. G., Volf, P. Kinetics of antibody response in BALB/c and C57BL/6 mice bitten by Phlebotomus papatasi. PLOS Neglected Tropical Diseases. 6, 1719 (2012).
  36. Mestas, J., Hughes, C. C. Of mice and not men: differences between mouse and human immunology. The Journal of Immunology. 172, 2731-2738 (2004).
  37. Ruane, D., Chorny, A., Lee, H., Faith, J., Pandey, G., Shan, M., Simchoni, N., Rahman, A., Garg, A., Weinstein, E. G., et al. Microbiota regulate the ability of lung dendritic cells to induce IgA class-switch recombination and generate protective gastrointestinal immune responses. The Journal of Experimental Medicine. 213, 53-73 (2016).
  38. Chorny, A., Puga, I., Cerutti, A. Innate signaling networks in mucosal IgA class switching. Advances in Immunology. 107, 31-69 (2010).
  39. Van Praet, J. T., Donovan, E., Vanassche, I., Drennan, M. B., Windels, F., Dendooven, A., Allais, L., Cuvelier, C. A., van de Loo, F., Norris, P. S., et al. Commensal microbiota influence systemic autoimmune responses. The EMBO Journal. 34, 466-474 (2015).
  40. Nguyen, Q. N., Himes, J. E., Martinez, D. R., Permar, S. R. The Impact of the Gut Microbiota on Humoral Immunity to Pathogens and Vaccination in Early Infancy. PLOS Pathogens. 12, 1005997 (2016).
  41. Jeevan-Raj, B. P., Robert, I., Heyer, V., Page, A., Wang, J. H., Cammas, F., Alt, F. W., Losson, R., Reina-San-Martin, B. Epigenetic tethering of AID to the donor switch region during immunoglobulin class switch recombination. The Journal of Experimental Medicine. 208, 1649-1660 (2011).
  42. Chen, Z., Getahun, A., Chen, X., Dollin, Y., Cambier, J. C., Wang, J. H. Imbalanced PTEN and PI3K Signaling Impairs Class Switch Recombination. The Journal of Immunology. 195, 5461-5471 (2015).
  43. Boboila, C., Yan, C., Wesemann, D. R., Jankovic, M., Wang, J. H., Manis, J., Nussenzweig, A., Nussenzweig, M., Alt, F. W. Alternative end-joining catalyzes class switch recombination in the absence of both Ku70 and DNA ligase 4. The Journal of Experimental Medicine. 207, 417-427 (2010).
  44. Shah, H. B., Koelsch, K. A. B-Cell ELISPOT: For the Identification of Antigen-Specific Antibody-Secreting Cells. Methods in Molecular Biology. 1312, 419-426 (2015).
  45. Bonsignori, M., Moody, M. A. Simultaneous Detection of Antigen-Specific IgG- and IgM-Secreting Cells with a B Cell Fluorospot Assay. Cells. 1, 15-26 (2012).
  46. Sasaki, Y., Derudder, E., Hobeika, E., Pelanda, R., Reth, M., Rajewsky, K., Schmidt-Supprian, M. Canonical NF-kappaB activity, dispensable for B cell development, replaces BAFF-receptor signals and promotes B cell proliferation upon activation. Immunity. 24, 729-739 (2006).
  47. Goodlad, J. R., Macartney, J. C. Germinal-center cell proliferation in response to T-independent antigens: a stathmokinetic, morphometric and immunohistochemical study in vivo. European Journal of Immunology. 25, 1918-1926 (1995).
  48. Xie, P., Poovassery, J., Stunz, L. L., Smith, S. M., Schultz, M. L., Carlin, L. E., Bishop, G. A. Enhanced Toll-like receptor (TLR) responses of TNFR-associated factor 3 (TRAF3)-deficient B lymphocytes. Journal of Leukocyte Biology. 90, 1149-1157 (2011).
  49. Kaku, H., Horikawa, K., Obata, Y., Kato, I., Okamoto, H., Sakaguchi, N., Gerondakis, S., Takatsu, K. NF-kappaB is required for CD38-mediated induction of C(gamma)1 germline transcripts in murine B lymphocytes. International Immunology. 14, 1055-1064 (2002).
  50. Dudley, D. D., Chaudhuri, J., Bassing, C. H., Alt, F. W. Mechanism and control of V(D)J recombination versus class switch recombination: similarities and differences. Advances in Immunology. 86, 43-112 (2005).
  51. Lange, H., Hecht, O., Zemlin, M., Trad, A., Tanasa, R. I., Schroeder, H. W., Lemke, H. Immunoglobulin class switching appears to be regulated by B-cell antigen receptor-specific T-cell action. European Journal of Immunology. 42, 1016-1029 (2012).
  52. Moore, C. R., Liu, Y., Shao, C. S., Covey, L. R., Morse, H. C., Xie, P. Specific deletion of TRAF3 in B lymphocytes leads to B lymphoma development in mice. Leukemia. 26, 1122-1127 (2012).
  53. Bergmann, B., Grimsholm, O., Thorarinsdottir, K., Ren, W., Jirholt, P., Gjertsson, I., Martensson, I. L. Memory B cells in mouse models. Scandinavian Journal of Immunology. 78, 149-156 (2013).
  54. McHeyzer-Williams, L. J., Milpied, P. J., Okitsu, S. L., McHeyzer-Williams, M. G. Class-switched memory B cells remodel BCRs within secondary germinal centers. Nature Immunology. 16, 296-305 (2015).
  55. Elgueta, R., Marks, E., Nowak, E., Menezes, S., Benson, M., Raman, V. S., Ortiz, C., O’Connell, S., Hess, H., Lord, G. M., et al. CCR6-dependent positioning of memory B cells is essential for their ability to mount a recall response to antigen. The Journal of Immunology. 194, 505-513 (2015).

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Lalani, A. I., Zhu, S., Xie, P. Characterization of Thymus-dependent and Thymus-independent Immunoglobulin Isotype Responses in Mice Using Enzyme-linked Immunosorbent Assay. J. Vis. Exp. (139), e57843, doi:10.3791/57843 (2018).

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