Análisis unicelular de Immunophenotype y producción de citoquinas en sangre periférica por citometría de masas
Summary
Aquí describimos un enfoque proteómico unicelular para evaluar inmunológico fenotípico y funcional (inducción de citocinas intracelulares) alteraciones en las muestras de sangre periférica, analizadas mediante citometría de masas.
Abstract
Las citoquinas juegan un papel fundamental en la patogénesis de enfermedades autoinmunes. Por lo tanto, la medición de los niveles de citocinas ha sido objeto de múltiples estudios en un intento de comprender los mecanismos precisos que conducen a la ruptura de la autotolerancia y autoinmunidad posterior. Enfoques hasta el momento se han basado en el estudio de un aspecto específico del sistema inmune (un solo o pocos tipos celulares o citocinas) y no ofrecen una evaluación global de la enfermedad autoinmune complejo. Mientras que estudios de sueros de pacientes han producido penetraciones importantes en autoinmunidad, no proporcionan la fuente celular específica de las citocinas de desajuste detectadas. Aquí se describe un enfoque integral de unicelular para evaluar la producción de citoquinas en varios subconjuntos de células inmunitarias, dentro del contexto de “intrínseco” específico para cada paciente de plasma factores de circulación. Este enfoque permite la monitorización de la paciente específico phenotype inmune (marcadores de superficie) y función (citoquinas), ya sea en su natural “intrínseca patógenos” enfermedad estatal, o en la presencia de agentes terapéuticos (in vivo o ex vivo).
Introduction
Las enfermedades autoinmunes son una causa importante de morbilidad y mortalidad que afecta a 3-8% de la población. En los Estados Unidos, trastornos autoinmunes se encuentran entre las principales causas de muerte entre las mujeres jóvenes y de mediana edad (edad < 65 años)1,2. Enfermedades autoinmunes se caracterizan por la presentación clínica heterogénea y los diversos procesos inmunológicos subyacentes. El espectro de la heterogeneidad del bien es representado a través de diferentes trastornos, como la participación conjunta en la artritis reumatoide (ar) y enfermedades neurológicas en la esclerosis múltiple (MS). Sin embargo, este nivel de heterogeneidad se ejemplifica también dentro de un desorden único, como el lupus eritematoso sistémico (les): algunos pacientes pueden presentar con patología renal, mientras que otros sufren de implicación hematológica o común3.
La inmunopatogénesis subyacente en los trastornos autoinmunitarios refleja la heterogeneidad clínica, con auto y hyper-activación de múltiples subconjuntos de la célula inmune innata y adaptativa y producción de citoquinas desregulación concomitante. Mientras que las citoquinas juegan un papel fundamental en la patogenia de la enfermedad autoinmune, entender su papel específico en el mecanismo de la enfermedad ha demostrado para ser un reto. Citocinas se caracterizan por pleiotropía (una citocina puede tener múltiples efectos en diferentes tipos de células), redundancia (varias citocinas pueden tener el mismo efecto), dualidad (una citocina puede tener efectos pro o antiinflamatoria bajo diversas condiciones), y plasticidad (citoquinas pueden ser moldeadas en un papel diferente de su “original”, según el medio ambiente)4,5,6. Por lo tanto, métodos de nivel de la población no pueden distinguir heterogéneas respuestas celulares a la misma «medio de cytokine”. Asimismo, diseños de los estudios que se centran en un aspecto específico del sistema inmune (un solo tipo de células o citocinas), no ofrecen una valoración global de todos los elementos que intervienen en complejas enfermedades autoinmunes. Mientras que estudios de sueros de pacientes han producido penetraciones importantes en autoinmunidad, no proporcionan la fuente celular específica de las citocinas de desajuste detectadas.
Recientemente, hemos desarrollado un enfoque proteómico unicelular para evaluar simultáneamente múltiples tipos de células inmunes y detectar sus diferentes perturbaciones de citoquinas en el medio de pacientes “patógenos” plasma de la sangre periférica circulante factores específicos. El flujo de trabajo descrito aquí se caracteriza por el uso de muestras de sangre periférica intacta, a diferencia de las células mononucleares aislados de sangre periférica (PBMCs). Sangre periférica representa el vehículo más fisiológicamente relevante para el estudio de enfermedad mediada inmune sistémica, incluyendo 1) no-células mononucleares de sangre a menudo implicados en enfermedad autoinmune (es decir, neutrófilos, plaquetas) y plasma 2) circulación de factores, tales como ácidos nucleicos, complejos inmunes y citocinas, que tienen funciones de activación inmunes. Para capturar la “intrínseca patógenos” desequilibrada producción de citoquinas, las muestras son procesadas inmediatamente después del sorteo de la sangre (T0, tiempo cero) y después de 6 h de incubación a 37 ° C (temperatura corporal fisiológica) con un transporte de la proteína periférica de la sangre inhibidor en la ausencia de cualquier condición estimulante exógeno (T6, tiempo 6 h), para detectar la producción de citoquinas (acumulación, T6-T0) que refleje el estado de “intrínseco” de la enfermedad (figura 1). Para el estudio de procesos de desregulación que reflejan sobre o debajo-activación de la señalización vías implicadas en las respuestas inmunológicas pertinentes a la enfermedad, las muestras de sangre periférica son tratados (6 h de incubación a 37 ° C con un inhibidor del transporte de la proteína) con una exógena estimular la condición que refleja la patogénesis de la enfermedad, como los agonistas de Toll-Like-Receptor (TLR) en el caso de SLE (T6 + R848, tiempo 6 h con 1 μg/mL R848), para detectar la producción de citoquinas que reflejaría una respuesta a los ácidos nucleicos (comparando T0 vs T6 vs T6 + R848, figura 1). Para estudiar los efectos inmunomoduladores de la terapéutica disponible ex vivo, lo que se refiere a los procesos de desregulación inmune precisa para ciertos pacientes, muestras de sangre periférica son tratadas con un inhibidor JAK en la correspondiente terapéutico concentración (aquí, 5 uM ruxolitinib; T6 + 5R, tiempo 6 h con 5 uM ruxolitinib), para detectar cambios en el estado de enfermedad “intrínseca” en respuesta a la droga (T0 vs T6 vs T6 + 5R, figura 1). Un inhibidor JAK fue elegido para este estudio porque inhibidores de JAK se han demostrado para tener éxito en el tratamiento de trastornos autoinmunes como la RA
Evaluar simultáneamente los procesos de estabilización descritos en varios subconjuntos de células inmunitarias, muestras de sangre periférica de SLE pacientes y controles sanos se procesada como se describió anteriormente y se analizaron por citometría de masas. Citometría de masas, también denominada citometría-tiempo de vuelo, ofrece análisis unicelular de parámetros más de 40 sin problemas de espectral solapan de8,7,9. Esta técnica utiliza isótopos metal de tierras raras en forma de iones metálicos solubles como etiquetas a los anticuerpos, en lugar de fluoróforos10. Detalles adicionales sobre la plataforma tecnológica de citometría de masas (es decir, ajuste y calibración, adquisición de muestra) se pueden encontrar en Leipold et al. y McCarthy et al. 11 , 12 la alta dimensionalidad de citometría de masas permite la medida simultánea de múltiples citocinas en subconjuntos de la célula inmune innata y adaptativa con granularidad unicelular (Tabla de materiales).
Parámetros clínicos y de laboratorio convencionales actuales no son a menudo sensible o lo suficientemente específicos para la detección de actividad de la enfermedad actual o la respuesta a los inmunomoduladores específicos13, reflejando la necesidad de delimitar mejor la inmune subyacente cambios que impulsan las llamaradas. Dada la omnipresencia del cytokine dysregulation en enfermedad autoinmune, tiene una plétora de enfoques de tratamiento que utilizan anticuerpos o inhibidores moleculares pequeños contra citoquinas o señalización de las proteínas implicadas en la regulación de la producción de citoquinas recientemente surgido. En su formato básico, el enfoque analítico de sangre periférica descrito aquí proporciona una plataforma para identificar subconjuntos de la célula altera específico para cada paciente y su producción anormal de citocinas en la enfermedad autoinmune con manifestaciones sistémicas. Esta metodología permite la personalización de opciones terapéuticas como citoquinas altera específico pueden ser identificados, y tratamiento específico pueden ser opciones prueba ex vivo para evaluar su capacidad de immunomodulate el paciente enfermedad específica proceso.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí describimos una novela, unicelular, enfoque proteómico para evaluar simultáneamente múltiples tipos de células inmunes y detectar sus diferentes perturbaciones de citoquinas en el ambiente de paciente “patógenos” plasma de la sangre periférica circulante factores específicos. Este método emplea sangre periférica como el vehículo analítico y la citometría de masas como herramienta para la evaluación de anormalidades fenotípicas y funcionales celulares inmunes. El método es fácilmente aplicable a huma…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nos gustaría agradecer a Aimee Pugh-Bernard por su entrada intelectual y comentarios útiles. Este trabajo fue apoyado por el Premio de investigación biomédica Boettcher Foundation Webb Waring y Premio número K23-1K23AR070897 de los NIH a Elena W.Y. Hsieh. Ella también fue apoyada por número de concesión HD000850 K12 del Eunice Kennedy Shriver Instituto Nacional de salud infantil y desarrollo humano y la Lucile Packard Foundation para la salud de los niños, Stanford CTSA UL1 TR001085 e investigación en salud infantil Instituto de Stanford University.
Materials
| Ruxolitinib | Santa Cruz | SC-364729A | Stock Conc: 10 mM; Final Conc: 5 μM |
| R848 | Invivogen | tlrl-r848-5 | Stock Conc: 1 μg/μL; Final Conc: 1 μg/mL |
| LPS-EK | Invivogen | tlrl-eklps | Stock Conc: 1 μg/μL; Final Conc: 0.1 μg/mL |
| Sterile PBS | Lonza | 17-516F | |
| Lyse/Fix Buffer | BD biosciences | 558049 | Stock Conc: 5X; Final Conc: 1X (dilute in ddH2O) |
| BD Phosflow perm/wash buffer I | BD biosciences | 557885 | Stock Conc: 10X; Final Conc: 1:10 (dilute in ddH2O) |
| RPMI | Gibco | 21870-076 | |
| Sodium Azide (NaN3) | Sigma-Aldrich | S-8032 | Stock Conc: >99.9%; Final Conc: 0.0002 |
| Protein Transport Inhibitor (PTI) | eBiosciences | 00-4980-93 | Stock Conc: 500X; Final Conc: 1X |
| DNA Intercalator | Fluidigm | 201192B | Stock Conc: 500 μM; Final Conc: 0.1 μM |
| Cell Staining Media (CSM) | PBS + 0.5% BSA, 0.02% NaN3 | ||
| MaxPar Barcode Perm Buffer | Fluidigm | 201057 | Stock Conc: 10X; Final Conc: 1X |
| 20-plex Pd Barcode Set | Fluidigm | S0014 | Stock Conc: n/a; Final Conc: n/a |
| EQ TM Four Element Calibration Beads | Fluidigm | 201078 | Stock Conc: 10X; Final Conc: 1X |
| 16% MeOH-free Formaldehyde Solution | Thermo | 28908 | Stock Conc: 16% (w/v); Final Conc: 1.6% (w/v) |
| Sterile round bottom polystyrene tubes | VWR | 60818-496 | Stock Conc: n/a; Final Conc: n/a |
| Polypropylene cluster tubes | Light Labs | A-9001 | Stock Conc: n/a; Final Conc: n/a |
| Helios CyTOF instrument | Fluidigm | Helios | All solutions to be used in CyTOF analysis need to be free of metal contamination. ddH2O is used in the preparation of any solutions should have a resistivity of at least 18.0 MΩ.cm. ddH2O and any self-prepared solutions should be stored in new plastic or glass bottles that have never been autoclaved. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies used for Mass Cytometry | |||
| Surface markers | |||
| CD1c | Biolegend | L161 | Mass: 161 |
| CD3 | BD | UCHT1 | Mass: 144 |
| CD4 | Biolegend | SK3 | Mass: 174 |
| CD7 | BD | M-T701 | Mass: 149 |
| CD8 | Biolegend | SK1 | Mass: 142 |
| CD11b | Fluidigm | ICRF44 | Mass: 209 |
| CD11c | BD | B-ly6 | Mass: 152 |
| CD15 | BD | HI98 | Mass: 115 |
| CD14 | Biolegend | M5E2 | Mass: 154 |
| CD16 | eBioscience/Thermo | B73.1 | Mass: 165 |
| CD19 | Santa Cruz | SJ25C1 | Mass: 163 |
| CD21 | Biolegend | Bu32 | Mass: 141 |
| CD27 | BD | L128 | Mass: 155 |
| CD38 | Fluidigm | HIT2 | Mass: 172 |
| CD45 total | Biolegend | HI30 | Mass: 89 |
| CD45RA | Biolegend | HI100 | Mass: 153 |
| CD56 | Miltenyi | REA196 | Mass: 168 |
| CD66 | BD | B1.1/CD66 | Mass: 113 |
| CD86 | Fluidigm | IT2.2 | Mass: 150 |
| CD123 | Fluidigm | 6H6 | Mass: 143 |
| CD278/ICOS | Biolegend | C398.4A | Mass: 156 |
| CD179/PD1 | Biolegend | EH12.2H7 | Mass: 162 |
| IgD | Biolegend | IA6-2 | Mass: 146 |
| IgM | Biolegend | MHM-88 | Mass: 151 |
| CXCR5 | BD | RF8B2 | Mass: 173 |
| HLADR | Biolegend | L243 | Mass: 167 |
| Cytokines | |||
| IL-1α | Biolegend | 364-3B3-14 | Mass: 147 |
| IL-1β | Biolegend | H1b-98 | Mass: 169 |
| IL-1RA | Santa Cruz | AS17 | Mass: 157 |
| IL-6 | Biolegend | MQ2-13A5 | Mass: 164 |
| IL-8 | BD | E8N1 | Mass: 160 |
| IL-12/IL-23p40 | Biolegend | C8.6 | Mass: 171 |
| IL-17A | Biolegend | BL168 | Mass: 148 |
| IL23p19 | eBioscience/Thermo | 23dcdp | Mass: 176 |
| MIP1β | BD | D21-1351 | Mass: 158 |
| MCP1 | BD | 5D3-F7 | Mass: 170 |
| IFNα | Miltenyi | LT27:295 | Mass: 175 |
| IFNγ | Biolegend | 4S.B3 | Mass: 165 |
| PTEN | BD | A2B1 | Mass: 159 |
| TNFα | Biolegend | Mab11 | Mass: 166 |
| Note: If the manufacturer is stated as Fluidigm, this antibody was purchased from Fluidigm with metal pre-conjugated. If the manufacturer is stated as other than Fluidigm, this antibody was self-conjugated using the MaxPar Multi-Metal Labeling Kit (Fluidigm Cat: 201300) according to manufacturer protocol. |
References
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