イムノフェノ タイプと大量のフローサイトメトリーによる末梢血中のサイトカイン産生の単一細胞解析
Summary
免疫表現型と機能 (細胞内サイトカイン誘導) を評価する単一細胞プロテオミクスの手法をここで述べる末梢全血サンプル、大量のフローサイトメトリーによる分析の変化。
Abstract
サイトカインは、自己免疫疾患の発症に重要な役割を果たします。したがって、サイトカインの測定以降自己免疫自己寛容の崩壊へとつながる正確なメカニズムを理解する試みの複数の研究の焦点となっています。アプローチはこれまで免疫システム (単一または少数細胞の種類またはサイトカイン) の 1 つの特定の側面に関する研究に基づいているし、複雑な自己免疫疾患の世界的な評価を提供していません。患者血清を用いた研究では、自己免疫に重要な洞察を与えている、間、調節不全サイトカインの検出の特定の細胞源は提供しません。循環要因、「本質的な」患者固有のプラズマのコンテキスト内で、複数の免疫細胞サブセットにおけるサイトカイン産生を評価する包括的な単一セルのアプローチを紹介します。このアプローチにより、患者固有の免疫表現型 (表面マーカー) の監視といずれかのネイティブ関数 (サイトカイン)”組み込み病原性」病状態、または治療薬 (in vivoまたは前のヴィヴォ) の存在。
Introduction
自己免疫疾患は、罹患率と死亡率が人口の 3-8% に影響を与える主要な原因です。自己免疫疾患は若年・中年層の女性の間で死の主要な原因の中で、アメリカ合衆国 (年齢 < 65 歳)1,2。自己免疫疾患は、異機種混在の臨床プレゼンテーションと多様な基になる免疫学プロセスによって特徴付けられます。不均一性のスペクトルも共同参画慢性関節リウマチ (RA) と神経疾患多発性硬化症 (MS) などの別の疾患の間で表されます。ただし、このレベルの不均一性の全身性エリテマトーデス (SLE) など、単一の障害内例でも: 何人かの患者は腎病理呈することがある血液や共同関与3他の人苦しむ間。
自己免疫疾患の基になる回は自動とハイパー-アクティブ化の複数の自然免疫と適応免疫細胞サブセットおよびサイトカイン産生調節不全の合併を含む、臨床不均質をミラー化します。サイトカインは、自己免疫疾患の発症に重要な役割を果たす、間は病気のメカニズムでの特定の役割を理解することに挑戦すると証明しました。サイトカインの発現によって特徴付けられる (1 つのサイトカインは、異なる種類の細胞に複数の効果を持つことができます)、(多数のサイトカインが同じ効果を持つことができます) の冗長性、二元性 (1 つのサイトカインは、異なる条件の下でプロや抗炎症効果を持つことができます)、可塑性 (サイトカインはその「オリジナル」の 1 つは、環境に応じて異なる役割に成形することができます)4,5,6。その結果、人口レベルのメソッドは、同じ「サイトカイン ・ ミリュー」レスポンスの異種細胞を区別できません。同様に、免疫システム (単一の細胞型またはサイトカイン) の 1 つの特定の側面に焦点を当てる研究デザインは、複雑な自己免疫疾患に関連するすべての要素のグローバル アセスメントを提供していません。患者血清を用いた研究では、自己免疫に重要な洞察を与えている、間、調節不全サイトカインの検出の特定の細胞源は提供しません。
最近では、同時に複数の免疫細胞の種類を評価し、患者の固有の”病原性「末梢血中循環要因環境の中で、さまざまなサイトカインの摂動を検出する単一細胞プロテオミクス手法を開発しました。ここで説明したワークフローは、孤立した末梢血単核球 (PBMCs) ではなく、そのまま末梢全血サンプルの使用が特徴です。末梢全血を表します (すなわち、好中球、血小板)、自己免疫疾患および 2) 血漿中しばしば関与 1) 非単核白血球細胞を含む、全身性の免疫疾患を勉強する最も生理学的関連車両核酸、免疫複合体、サイトカインなどの要因を循環免疫活性化の役割があります。キャプチャする、”本質的な病原性「サイトカイン産生調節不全、末梢血サンプル処理直後に血液 (T0、時間ゼロ) とタンパク質輸送の 37 ° c (生理的体温) 6 時間後「本質的な」病気の状態 (図 1) を反映するサイトカイン産生 (蓄積、T6 T0) を検出する外因性刺激条件 (T6、時間 6 h)、不在の阻害剤。外因性物質と扱われる (タンパク質輸送阻害剤と 37 ° C で 6 時間培養) を上反映調節不全プロセスやシグナル伝達経路、病気に関連する免疫応答に関与する末梢血サンプルの下活性化研究サイトカイン産生核酸への応答を反映するを検出する (T6 + R848、時間 6 h 1 μ g/ml の R848)、SLE の場合フリー ダイヤル様受容体 (TLR) アゴニストなどの病気の発症を反映する条件を刺激 (対 T0、T6 T6 対の比較 +R848、図 1)。特定の患者のための免疫調節不全の正確なプロセスに関連する利用できる治療前のヴィヴォの免疫調節効果を勉強するには、末梢血サンプルは治療に関連する JAK 阻害で扱われています。濃度 (ここでは、5 uM ruxolitinib;T6 + 5R、時間 6 h 5 uM ruxolitinib)、(対 T0、T6 T6 対 + 5R、図 1) 薬物への応答で「本質的な」病気の状態の変化を検出します。JAK 阻害剤がラーなど自己免疫疾患の治療に成功するために示されているために、この研究のため選ばれたの JAK 阻害剤
同時に複数の免疫細胞のサブセットは、sle 患者末梢血サンプルで説明した調節不全のプロセスを評価するには、患者と健常者だった前述の処理し、質量フローサイトメトリーで分析します。として知られているフローサイトメトリー-飛行時間型の質量フローサイトメトリーはスペクトルの問題7,8,9の重複なし 40 を超えるパラメーターの単一細胞解析を提供しています。この手法は、行きの抗体の同時10の代わりにタグとして水溶性の金属イオンの形で希土類金属の同位体を利用しています。リチャードライポルトらとマッカーシーらの (すなわち、チューニングし校正、サンプルの収集) 質量フローサイトメトリーの技術プラットフォームに関する詳細を見つけることができます。11,12質量フローサイトメトリーの高次元単一セルの粒度 (材料表) と自然免疫と適応免疫の細胞のサブセットの中で複数のサイトカインの同時測定が可能。 にします。
従来の臨床的および検査パラメーターを現在は多くの場合機密情報や継続的な疾患活動性または特定免疫13より根本的な免疫を線引きする必要性を反映する応答を検出するために十分に特定再燃をドライブの変更。自己免疫疾患におけるサイトカイン調節不全の普及を考えると、抗体または小分子阻害剤サイトカインをターゲットやサイトカイン産生の調節に関与するタンパク質のシグナルを使用する処置のアプローチの茄多があります。最近浮上しました。その基本的な形式では、ここで説明した末梢血分析アプローチは、患者固有の調節不全の細胞のサブセットと全身症状と自己免疫疾患での異常なサイトカイン生産を識別するためのプラットフォームを提供します。この方法により治療法の選択の個人用設定を特定の調節不全サイトカインを識別できるとオプションは、特定の治療法をテスト immunomodulate する能力を評価するためにex vivo患者特定疾患プロセス。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで小説、単一セル、種類の免疫細胞を同時に評価し、患者の固有の”病原性「末梢血中循環要因環境の中で、さまざまなサイトカインの摂動を検出するプロテオミクスの手法について述べる。このメソッドでは、分析の車両と免疫細胞の表現型および機能異常の評価のためのツールとして質量フローサイトメトリー末梢全血を採用しています。メソッドは、人間およびマウス研究<sup class="…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
彼女の知的入力と有用なコメントがエイミー ピュー-ベルナールに感謝したいと思います。この作品は、生物医学研究賞のベッチャー財団ウェッブ waring 氏と番号 K23 1K23AR070897 NIH からエレナ大学院謝によって支えられました。彼女はまた子供の健康、スタンフォード CTSA UL1 TR001085 と子供の健康の研究のため受賞番号 K12 HD000850ユーニス · ケネディ · シュライバー国立研究所からの母子保健と人間開発とルシル Packard 財団によって支えられました。スタンフォード大学の研究所の大学。
Materials
| Ruxolitinib | Santa Cruz | SC-364729A | Stock Conc: 10 mM; Final Conc: 5 μM |
| R848 | Invivogen | tlrl-r848-5 | Stock Conc: 1 μg/μL; Final Conc: 1 μg/mL |
| LPS-EK | Invivogen | tlrl-eklps | Stock Conc: 1 μg/μL; Final Conc: 0.1 μg/mL |
| Sterile PBS | Lonza | 17-516F | |
| Lyse/Fix Buffer | BD biosciences | 558049 | Stock Conc: 5X; Final Conc: 1X (dilute in ddH2O) |
| BD Phosflow perm/wash buffer I | BD biosciences | 557885 | Stock Conc: 10X; Final Conc: 1:10 (dilute in ddH2O) |
| RPMI | Gibco | 21870-076 | |
| Sodium Azide (NaN3) | Sigma-Aldrich | S-8032 | Stock Conc: >99.9%; Final Conc: 0.0002 |
| Protein Transport Inhibitor (PTI) | eBiosciences | 00-4980-93 | Stock Conc: 500X; Final Conc: 1X |
| DNA Intercalator | Fluidigm | 201192B | Stock Conc: 500 μM; Final Conc: 0.1 μM |
| Cell Staining Media (CSM) | PBS + 0.5% BSA, 0.02% NaN3 | ||
| MaxPar Barcode Perm Buffer | Fluidigm | 201057 | Stock Conc: 10X; Final Conc: 1X |
| 20-plex Pd Barcode Set | Fluidigm | S0014 | Stock Conc: n/a; Final Conc: n/a |
| EQ TM Four Element Calibration Beads | Fluidigm | 201078 | Stock Conc: 10X; Final Conc: 1X |
| 16% MeOH-free Formaldehyde Solution | Thermo | 28908 | Stock Conc: 16% (w/v); Final Conc: 1.6% (w/v) |
| Sterile round bottom polystyrene tubes | VWR | 60818-496 | Stock Conc: n/a; Final Conc: n/a |
| Polypropylene cluster tubes | Light Labs | A-9001 | Stock Conc: n/a; Final Conc: n/a |
| Helios CyTOF instrument | Fluidigm | Helios | All solutions to be used in CyTOF analysis need to be free of metal contamination. ddH2O is used in the preparation of any solutions should have a resistivity of at least 18.0 MΩ.cm. ddH2O and any self-prepared solutions should be stored in new plastic or glass bottles that have never been autoclaved. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies used for Mass Cytometry | |||
| Surface markers | |||
| CD1c | Biolegend | L161 | Mass: 161 |
| CD3 | BD | UCHT1 | Mass: 144 |
| CD4 | Biolegend | SK3 | Mass: 174 |
| CD7 | BD | M-T701 | Mass: 149 |
| CD8 | Biolegend | SK1 | Mass: 142 |
| CD11b | Fluidigm | ICRF44 | Mass: 209 |
| CD11c | BD | B-ly6 | Mass: 152 |
| CD15 | BD | HI98 | Mass: 115 |
| CD14 | Biolegend | M5E2 | Mass: 154 |
| CD16 | eBioscience/Thermo | B73.1 | Mass: 165 |
| CD19 | Santa Cruz | SJ25C1 | Mass: 163 |
| CD21 | Biolegend | Bu32 | Mass: 141 |
| CD27 | BD | L128 | Mass: 155 |
| CD38 | Fluidigm | HIT2 | Mass: 172 |
| CD45 total | Biolegend | HI30 | Mass: 89 |
| CD45RA | Biolegend | HI100 | Mass: 153 |
| CD56 | Miltenyi | REA196 | Mass: 168 |
| CD66 | BD | B1.1/CD66 | Mass: 113 |
| CD86 | Fluidigm | IT2.2 | Mass: 150 |
| CD123 | Fluidigm | 6H6 | Mass: 143 |
| CD278/ICOS | Biolegend | C398.4A | Mass: 156 |
| CD179/PD1 | Biolegend | EH12.2H7 | Mass: 162 |
| IgD | Biolegend | IA6-2 | Mass: 146 |
| IgM | Biolegend | MHM-88 | Mass: 151 |
| CXCR5 | BD | RF8B2 | Mass: 173 |
| HLADR | Biolegend | L243 | Mass: 167 |
| Cytokines | |||
| IL-1α | Biolegend | 364-3B3-14 | Mass: 147 |
| IL-1β | Biolegend | H1b-98 | Mass: 169 |
| IL-1RA | Santa Cruz | AS17 | Mass: 157 |
| IL-6 | Biolegend | MQ2-13A5 | Mass: 164 |
| IL-8 | BD | E8N1 | Mass: 160 |
| IL-12/IL-23p40 | Biolegend | C8.6 | Mass: 171 |
| IL-17A | Biolegend | BL168 | Mass: 148 |
| IL23p19 | eBioscience/Thermo | 23dcdp | Mass: 176 |
| MIP1β | BD | D21-1351 | Mass: 158 |
| MCP1 | BD | 5D3-F7 | Mass: 170 |
| IFNα | Miltenyi | LT27:295 | Mass: 175 |
| IFNγ | Biolegend | 4S.B3 | Mass: 165 |
| PTEN | BD | A2B1 | Mass: 159 |
| TNFα | Biolegend | Mab11 | Mass: 166 |
| Note: If the manufacturer is stated as Fluidigm, this antibody was purchased from Fluidigm with metal pre-conjugated. If the manufacturer is stated as other than Fluidigm, this antibody was self-conjugated using the MaxPar Multi-Metal Labeling Kit (Fluidigm Cat: 201300) according to manufacturer protocol. |
References
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