Einzellige Analyse der Immunophenotype und Produktion von Zytokinen im peripheren Blut über Masse Zytometrie

Summary

Hier beschreiben wir einen Einzellige Proteomic Ansatz um Immune phänotypische und funktionelle (intrazelluläre Zytokin Induktion) bewerten Veränderungen in peripheren Vollblut Proben, über Masse zytometrie analysiert.

Abstract

Zytokine spielen eine zentrale Rolle in der Pathogenese von Autoimmunkrankheiten. Daher wurde die Messung der Zytokin Ebenen der Schwerpunkt von mehreren Studien in einem Versuch, die genauen Mechanismen zu verstehen, die zum Zusammenbruch der Selbsttoleranz und anschließende Autoimmunität führen. Ansätze bisher basieren auf der Studie einen spezifischen Aspekt des Immunsystems (Single oder paar Zelltypen oder Zytokine) und bieten keine umfassende Beurteilung der komplexen Autoimmunerkrankung. Während Sera-basierten Studien Patienten wichtige Erkenntnisse zur Autoimmunität geleistet haben, bieten sie nicht die spezifische zelluläre Quelle der Dysregulated Zytokine entdeckt. Eine einzellige Gesamtkonzept für die Produktion von Zytokinen in mehreren Immunzelle Teilmengen im Rahmen des “intrinsische” Patienten-spezifischen Plasma zirkulierenden Faktoren zu bewerten ist hier beschrieben. Dieser Ansatz ermöglicht die Überwachung des Patienten-spezifischen immun Phänotyps (oberflächenmarker) und Funktion (Zytokine), entweder in seiner Heimat “inneren pathogenen” Krankheit Staat, oder in der Gegenwart von Therapeutika (in Vivo und ex Vivo).

Introduction

Autoimmunerkrankungen sind eine der Hauptursachen für Morbidität und Mortalität 3-8 % der Bevölkerung betroffen. In den Vereinigten Staaten, autoimmune-Erkrankungen gehören zu den führenden Todesursachen bei junge und Mittelalte Frauen (Alter < 65 Jahre)^1,2. Autoimmune-Erkrankungen zeichnen sich durch heterogene klinische Präsentation und unterschiedlichen zugrunde liegenden immunologische Prozesse. Das Spektrum der Heterogenität ist über verschiedene Störungen, wie gemeinsame Beteiligung bei der rheumatoiden Arthritis (RA) und neurologische Erkrankung bei multipler Sklerose (MS) vertreten. Dieses Maß an Heterogenität zeigt jedoch auch innerhalb einer einzelnen Störung, wie systemischer Lupus erythematodes (SLE): bei einigen Patienten können mit renal Pathologie präsentieren, während andere leiden an hämatologischen oder gemeinsame Beteiligung³.

Die zugrunde liegenden immunpathogenese in Autoimmun-Erkrankungen spiegelt die klinische Heterogenität, mit Auto – und hyper-Aktivierung von angeborenen und der adaptiven Immunzelle Teilmengen und damit einhergehende Dysregulated Produktion von Zytokinen. Während Zytokine eine zentrale Rolle in der Pathogenese von Autoimmunkrankheiten spielen, nachweislich verstehen ihre besondere Rolle in den Mechanismus der Krankheit eine Herausforderung sein. Zytokine sind geprägt von Pleiotropie (ein Zytokin kann mehrere Effekte auf verschiedene Zelltypen haben), Redundanz (mehrere Zytokine können die gleiche Wirkung haben), Dualität (ein Zytokin kann pro- und antiinflammatorische Effekte unter verschiedenen Bedingungen haben), und Plastizität (Zytokine können in eine Rolle unterscheidet sich von der “original”, je nach Umgebung geformt werden)^4,5,6. Folglich können nicht Populationsebene Methoden heterogene zelluläre Reaktionen auf die gleichen “Zytokin-Milieu” unterscheiden. In ähnlicher Weise bieten Studiendesigns, die sich auf einen spezifischen Aspekt des Immunsystems (eine einzelne Zellentyp oder Cytokine), keine Gesamtbewertung aller Elemente in komplexen Autoimmunkrankheit beteiligt. Während Sera-basierten Studien Patienten wichtige Erkenntnisse zur Autoimmunität geleistet haben, bieten sie nicht die spezifische zelluläre Quelle der Dysregulated Zytokine entdeckt.

Vor kurzem haben wir einen einzelligen Proteomic Ansatz zur Bewertung gleichzeitig mehrere Arten von Immunzellen und ihre verschiedenen Zytokin-Störungen im Umfeld des Patienten spezifische “pathogenen” peripheren Blutplasma zirkulierende Faktoren zu erkennen. Die hier beschriebene Workflow zeichnet sich durch die Verwendung von intakten peripheren Vollblut-Proben, im Gegensatz zu isolierten peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs). Peripheren Blut stellt die meisten physiologisch relevante Fahrzeug immun-vermittelte systemerkrankung, einschließlich 1) nicht-mononukleären Blutzellen oft eingebunden in Autoimmunerkrankung (d.h., Neutrophilen Granulozyten und Thrombozyten) und Plasma (2) studieren zirkulierenden Faktoren wie Nukleinsäuren, Immunkomplexe und Zytokine, haben die immun aktivierende Rollen. Erfassen der “inneren pathogenen” Dysregulated Produktion von Zytokinen, peripherem Blut Proben unmittelbar nach der Blutentnahme (T0, Stunde Null), und nach 6 h Inkubation bei 37 ° C (physiologische Körpertemperatur) mit einem Protein-Transport erfolgt Inhibitor bei fehlender exogene anregende Zustand (T6, Zeit 6 h), Produktion von Zytokinen (Akkumulation, T6-T0) erkennen, die die “intrinsische” Krankheitszustandes (Abbildung 1) widerspiegeln würde. Dysregulated Prozesse, die über widerspiegeln oder unter Aktivierung der Signalwege in Immunreaktionen relevant für die Krankheit, periphere Blutproben sind zu studieren (6 h Inkubation bei 37 ° C mit einem Protein-Transport-Inhibitor) mit einer exogenen behandelt Bedingung, die Pathogenese der Krankheit, wie Toll-Like-Rezeptor (TLR) Agonisten bei SLE (T6 + R848, mal 6 h mit 1 µg/mL R848), um die Produktion von Zytokinen zu erkennen, die eine Reaktion auf Nukleinsäuren widerspiegeln würde reflektiert anregend (Vergleich T0 vs. T6 vs. T6 + R848, Abbildung 1). Um immunmodulatorische Effekte von verfügbaren Therapeutika ex Vivo, studieren, wie sie die präzise immun Dysregulated Prozesse für bestimmte Patienten betreffen, werden mit einem JAK Inhibitor bei den relevanten therapeutischen peripherem Blutproben behandelt. Konzentration (hier 5 Umm Ruxolitinib; T6 + 5R, mal 6 h mit 5 Umm Ruxolitinib), zum Erkennen von Änderungen in “intrinsische” Krankheit Staat als Reaktion auf das Medikament (T0 vs. T6 vs. T6 + 5R, Abbildung 1). Ein JAK Inhibitor wurde für diese Studie ausgewählt, weil JAK-Hemmer nachweislich erfolgreich bei der Behandlung von Autoimmun-Krankheiten wie RA

Um gleichzeitig in mehreren Immunzelle Teilmengen, periphere Blutproben von SLE beschriebenen Dysregulated-Prozesse bewerten wurden Patienten und gesunden Kontrollpersonen verarbeitet, wie oben beschrieben und analysiert durch Masse zytometrie. Masse zytometrie, auch bekannt als Zytometrie-Time-Of-Flight, bietet einzellige Analyse von über 40 Parametern ohne Probleme der spektralen^7,8,9überlappen. Diese Technik nutzt seltene Erden Metall-Isotope in Form von löslichen Metall-Ionen als Tags an Antikörpern, statt Fluorophore¹⁰gebunden. Zusätzliche Details bezüglich der Masse zytometrie technological Platform (d.h., tuning und Kalibrierung, Probe Erwerb) finden Sie im Leipold Et Al. und McCarthy Et al. ^{11 , 12} High-Dimensionalität der Masse zytometrie ermöglicht gleichzeitige Messung mehrerer Zytokine in angeborene und adaptive Immunzellen Teilmengen mit einzelligen Granularität (Table of Materials).

Aktuelle konventionellen klinischen und Labor-Parameter sind oft nicht empfindlich oder spezifisch genug, zur Erkennung von laufenden Krankheitsaktivität oder die Reaktion auf bestimmte Immunmodulatoren¹³, reflektieren die Notwendigkeit, das zugrunde liegende Immunsystem besser abzugrenzen Änderungen, die Schübe zu fahren. Angesichts die Allgegenwart der Cytokine Dysregulation bei Autoimmunerkrankung, haben eine Vielzahl von Behandlungsansätzen, die Antikörper oder kleine Molekulare Inhibitoren targeting Zytokine oder signalproteinen beteiligt bei der Regulierung der Produktion von Zytokinen verwenden vor kurzem entstanden. In ihrer grundlegenden Form bietet der hier beschriebene peripherem Blut analytische Ansatz eine Plattform um patientenspezifische Dysregulated Zelle Teilmengen und ihre abnorme Zytokin-Produktion in Autoimmunerkrankung mit systemischen Manifestationen zu identifizieren. Diese Methodik ermöglicht die Personalisierung von therapeutischen Möglichkeiten wie spezifische Dysregulated Zytokine identifiziert werden können, und eine spezifische Behandlung, die Optionen Ex Vivo getestet zu ihrer Fähigkeit, Immunomodulate zu beurteilen Patienten spezifische Krankheit Prozesses.

Protocol

Alle hier beschriebene Methoden sind durch die Colorado mehrere institutionelle Review Board (COMIRB) von der University of Colorado genehmigt worden. Alle unten beschriebene Verfahren sollte in einem sterilen Gewebekultur Abzug durchgeführt werden, sofern nichts anderes mit gefilterten Pipettenspitzen und alle Reagenzien gefiltert. 1. Vorbereitung der Reagenzien für die peripheren Vollblut Verarbeitung Bereiten Sie Ruxolitinib Lager Aliquote (10 – 15 μl/Vial zur Einzelnutzung) …

Representative Results

Abbildung 1 zeigt den Workflow für die Stimulation und Verarbeitung der peripheren Blutproben, einschließlich Zuweisung von Blut Probe Aliquote, Timing der Zusatz von Stimulation, Protein Inhibitor cocktail, und Inkubation Zeiten bis zur Lyse der Erythrozyten (RBC) und Fixierung. Die Wahl der anregenden Agenten hängt von der Signal- und Cytokine Bahnen, die für die Bewertung ausgerichtet sind. Beispielsweise werden in dem hier beschriebenen Protokoll TLR-…

Discussion

Hier beschreiben wir eine neuartige, einzellige, Proteomic Ansatz für mehrere Immunzelle Arten gleichzeitig zu beurteilen und ihre verschiedenen Zytokin-Störungen im Umfeld des Patienten spezifische “pathogenen” peripheren Blutplasma zirkulierende Faktoren zu erkennen. Diese Methode setzt peripheren Vollblut sowie die analytische Fahrzeug Masse zytometrie als Instrument für die Bewertung der immunologischen zellulären phänotypische und funktionelle Veränderungen. Die Methode ist leicht anwendbar auf Menschen und M?…

Materials

Ruxolitinib	Santa Cruz	SC-364729A	Stock Conc: 10 mM; Final Conc: 5 μM
R848	Invivogen	tlrl-r848-5	Stock Conc: 1 μg/μL; Final Conc: 1 μg/mL
LPS-EK	Invivogen	tlrl-eklps	Stock Conc: 1 μg/μL; Final Conc: 0.1 μg/mL
Sterile PBS	Lonza	17-516F
Lyse/Fix Buffer	BD biosciences	558049	Stock Conc: 5X; Final Conc: 1X (dilute in ddH2O)
BD Phosflow perm/wash buffer I	BD biosciences	557885	Stock Conc: 10X; Final Conc: 1:10 (dilute in ddH2O)
RPMI	Gibco	21870-076
Sodium Azide (NaN3)	Sigma-Aldrich	S-8032	Stock Conc: >99.9%; Final Conc: 0.0002
Protein Transport Inhibitor (PTI)	eBiosciences	00-4980-93	Stock Conc: 500X; Final Conc: 1X
DNA Intercalator	Fluidigm	201192B	Stock Conc: 500 μM; Final Conc: 0.1 μM
Cell Staining Media (CSM)			PBS + 0.5% BSA, 0.02% NaN3
MaxPar Barcode Perm Buffer	Fluidigm	201057	Stock Conc: 10X; Final Conc: 1X
20-plex Pd Barcode Set	Fluidigm	S0014	Stock Conc: n/a; Final Conc: n/a
EQ TM Four Element Calibration Beads	Fluidigm	201078	Stock Conc: 10X; Final Conc: 1X
16% MeOH-free Formaldehyde Solution	Thermo	28908	Stock Conc: 16% (w/v); Final Conc: 1.6% (w/v)
Sterile round bottom polystyrene tubes	VWR	60818-496	Stock Conc: n/a; Final Conc: n/a
Polypropylene cluster tubes	Light Labs	A-9001	Stock Conc: n/a; Final Conc: n/a
Helios CyTOF instrument	Fluidigm	Helios	All solutions to be used in CyTOF analysis need to be free of metal contamination. ddH2O is used in the preparation of any solutions should have a resistivity of at least 18.0 MΩ.cm. ddH2O and any self-prepared solutions should be stored in new plastic or glass bottles that have never been autoclaved.
Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibodies used for Mass Cytometry
Surface markers
CD1c	Biolegend	L161	Mass: 161
CD3	BD	UCHT1	Mass: 144
CD4	Biolegend	SK3	Mass: 174
CD7	BD	M-T701	Mass: 149
CD8	Biolegend	SK1	Mass: 142
CD11b	Fluidigm	ICRF44	Mass: 209
CD11c	BD	B-ly6	Mass: 152
CD15	BD	HI98	Mass: 115
CD14	Biolegend	M5E2	Mass: 154
CD16	eBioscience/Thermo	B73.1	Mass: 165
CD19	Santa Cruz	SJ25C1	Mass: 163
CD21	Biolegend	Bu32	Mass: 141
CD27	BD	L128	Mass: 155
CD38	Fluidigm	HIT2	Mass: 172
CD45 total	Biolegend	HI30	Mass: 89
CD45RA	Biolegend	HI100	Mass: 153
CD56	Miltenyi	REA196	Mass: 168
CD66	BD	B1.1/CD66	Mass: 113
CD86	Fluidigm	IT2.2	Mass: 150
CD123	Fluidigm	6H6	Mass: 143
CD278/ICOS	Biolegend	C398.4A	Mass: 156
CD179/PD1	Biolegend	EH12.2H7	Mass: 162
IgD	Biolegend	IA6-2	Mass: 146
IgM	Biolegend	MHM-88	Mass: 151
CXCR5	BD	RF8B2	Mass: 173
HLADR	Biolegend	L243	Mass: 167
Cytokines
IL-1α	Biolegend	364-3B3-14	Mass: 147
IL-1β	Biolegend	H1b-98	Mass: 169
IL-1RA	Santa Cruz	AS17	Mass: 157
IL-6	Biolegend	MQ2-13A5	Mass: 164
IL-8	BD	E8N1	Mass: 160
IL-12/IL-23p40	Biolegend	C8.6	Mass: 171
IL-17A	Biolegend	BL168	Mass: 148
IL23p19	eBioscience/Thermo	23dcdp	Mass: 176
MIP1β	BD	D21-1351	Mass: 158
MCP1	BD	5D3-F7	Mass: 170
IFNα	Miltenyi	LT27:295	Mass: 175
IFNγ	Biolegend	4S.B3	Mass: 165
PTEN	BD	A2B1	Mass: 159
TNFα	Biolegend	Mab11	Mass: 166
Note: If the manufacturer is stated as Fluidigm, this antibody was purchased from Fluidigm with metal pre-conjugated. If the manufacturer is stated as other than Fluidigm, this antibody was self-conjugated using the MaxPar Multi-Metal Labeling  Kit (Fluidigm Cat: 201300) according to manufacturer protocol.