Summary

Cuantificación de Vibrio cholerae de colonización y de la diarrea en el modelo de pez cebra adulto

Published: July 12, 2018
doi:

Summary

Pez cebra son un natural Vibrio cholerae anfitrión y se puede utilizar para recapitular y estudiar el ciclo infeccioso de colonización a la transmisión. Aquí, demostramos cómo evaluar niveles de colonización de V. cholerae y cuantificar diarrea en pez cebra.

Abstract

Vibrio cholerae es mejor conocido como el agente infeccioso que causa el cólera enfermedad humana. Fuera del huésped humano, V. cholerae sobre todo existe en el medio acuático, donde interactúa con una variedad de especies acuáticas más altas. Vertebrados peces son conocidos por ser un anfitrión de medio ambiente y son un reservorio potencial de V. cholerae en la naturaleza. V. cholerae y las especies de peces teleósteos Danio rerio, conocidas comúnmente como el pez cebra, originan el subcontinente indio, lo que sugiere una interacción prolongada en ambientes acuáticos. Pez cebra son un organismo modelo para estudiar muchos aspectos de la biología, incluyendo enfermedades infecciosas. Pez cebra puede ser fácilmente y rápidamente colonizado por V. cholerae después de la exposición en agua. Colonización intestinal por V. cholerae conduce a la producción de la diarrea y la excreción de replicado V. cholerae. Estos excretan bacterias puede entonces ir a colonizar nuevos huéspedes de pescado. Aquí, demostramos cómo evaluar V. cholerae-colonización intestinal en pez cebra y cómo cuantificar V. cholerae-indujo diarrea de pez cebra. El modelo de colonización debe ser útil a los investigadores que están estudiando si los genes de interés pueden ser importantes para la colonización del huésped o supervivencia ambiental. La cuantificación de pez cebra diarrea debe ser útil a los investigadores estudiar cualquier patógeno intestinal que están interesados en explorar el pez cebra como modelo.

Introduction

Vibrio cholerae es una bacteria acuática, gram-negativa que provoca la cólera de la enfermedad humana como diarrea esporádica1,2. V. cholerae se encuentra en el medio ambiente en muchas áreas del globo, a menudo asociado con otros organismos acuáticos. Estos organismos asociando incluyen plancton, masas de huevos de insectos, crustáceos y vertebrados peces especies3,4,5,6,7. Varios estudios han aislado V. cholerae de los tractos intestinales de peces en diferentes áreas geográficas7,8,9,10. La presencia de V. cholerae en pescados indica que los peces pueden actuar como un reservorio ambiental. Peces también podrían estar implicados en la transmisión de la enfermedad a los seres humanos y en la difusión geográfica de V. cholerae las cepas6.

Para entender mejor cómo V. cholerae interactúa con pescado, Danio rerio, mejor conocido como pez cebra, fue desarrollado como un sistema modelo para el estudio de V. cólerae11. Pez cebra son nativas de Asia meridional, incluyendo la región de la bahía de Bengala, que se piensa para ser el primer reservorio de V. cholerae. Antes del primer comienzo pandemia de cólera en 1817, cólera no había divulgado fuera de lo que hoy es India y Bangladesh. Por lo tanto, pez cebra y V. cholerae seguramente asociados con otros sobre escalas de tiempo evolutivo, sugiriendo que pez cebra se encuentran a V. cholerae en el ambiente natural12.

El modelo de pez cebra para V. cholerae es simple de ejecutar y se puede utilizar para estudiar el patógeno entero ciclo de vida de V. cholerae . Peces están expuestos a V. cholerae por bañarse en el agua que ha sido inoculado con una cantidad conocida de V. cholerae. Dentro de unas horas, colonización intestinal tiene lugar, seguido por la producción de diarrea. Diarrea consiste en mucina, proteínas, bacterias excretadas y otros contenido intestinal. El grado de diarrea puede cuantificarse usando unos simples medidas13. V. cholerae que ha sido excretada por los peces infectados puede entonces pasar al infectar peces ingenuos, completando el ciclo infeccioso. Por lo tanto, el modelo de pez cebra recapitula el V. cholerae enfermedades humanas proceso12,14.

Lo más frecuentemente usado V. cholerae modelos animales han sido históricamente ratones y conejos14,15,16,17,18. Estos modelos han sido instrumentales en la adición a nuestro conocimiento de V. cholerae patogenia. Sin embargo, porque los ratones y los conejos no son natural V. cholerae hosts, hay limitaciones qué aspectos del ciclo de vida V. cholerae pueden ser estudiado. La colonización de V. cholerae de ratones y conejos por lo general requiere la ausencia de microbiota intestinal o un tratamiento previo con antibióticos para dañar la microbiota intestinal. Ambos modelos requieren sonda nasogástrica para introducir las bacterias del tracto digestivo o manipulación quirúrgica para inyectar directamente las bacterias en los intestinos. Pez cebra tienen una ventaja en que peces adultos con una microbiota intestinal intacta son fácilmente colonizados y el proceso infeccioso ocurre naturalmente, sin ninguna manipulación necesaria.

El presente trabajo muestra la utilización del pez cebra como modelo en la infección por V. cholerae . La infección, la disección, enumeración de colonización V. choleraey la cuantificación de la diarrea causada por V. cholerae será descrito12,13. Este modelo es probable ser útil para los científicos interesados en el proceso de la enfermedad de V. cholerae y el V. cholerae ambiental estilo de vida.

Protocol

Todos los métodos aquí descritos han sido aprobados por el institucional Animal Care y el Comité uso (IACUC) de la Universidad Estatal de Wayne. Este método primero fue descrito en Runft et al. 12 1. determinación de los niveles de colonización Intestinal Nota: Colonización Intestinal es la métrica más útil en el modelo del pez cebra como puede ser utilizado para comparar la aptitud relativa de varias cepas de V. cholerae…

Representative Results

V. cholerae la colonización del tracto intestinal de pez cebra Para proporcionar un ejemplo de los niveles de colonización típica que observamos, inocularon 5 x 106 UFC de la pandemia EL Tor V. cholerae cepa N16961 en 200 mL de agua en un vaso de precipitados que contiene varios peces cebra. Después de 6 h de infección, los peces eran lavados en agua dulce y transferidos a un vaso de precipitados d…

Discussion

El pez cebra es un modelo relativamente nuevo para el estudio de V. cholerae pero tiene mucho potencial para el descubrimiento futuro de aspectos desconocidos de V. cholerae biología y patogénesis11,12,13 . El modelo de pez cebra adulto tiene las ventajas de ser ambos naturales V. cholerae host que contiene microbiota intestinal intacta, maduro y un modelo ambiental. Desventajas del modelo son que lo…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gracias a la melodía Neely, Jon Allen, Basilea Abuaita y Donna Runft por sus esfuerzos en ayudar a desarrollar el modelo de pez cebra. La investigación divulgada aquí fue apoyada por el Instituto Nacional de alergias y enfermedades infecciosas de los institutos nacionales de salud, números de concesión R21AI095520 y R01AI127390 (a Jeffrey H. Withey). El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representan necesariamente las opiniones oficiales de los institutos nacionales de salud.

Materials

Instrument
Shaker incubator New Brunswick Scientific, Edison, NJ Excella E25
Incubator NUAIRE, Plymouth, MN Auto Flow
Spectrophotometer Thermo, Waltham, MA Geaesys 6
Vortex homogenizer Minibeadbeater24 112011
Weighing Machine Ohaus, Columbia, MD Adventurer Pro
Heat Stirer Corning, Corning, NY PC-420D
Burner
automated colony counter REVSCI 120417B
Materials
400 ml glass beakers Pyrex
perforated lids Microtip holder with holes from tip box
disposable plastic spoons Office Depot, Boca Raton, FL D15-25-7008
Fish Tank System Aquaneering, San Diego, CA
RO Water Purifier Aqua FX TK001
Fish net Marina
fish food Tetra fin
Brine Shrimp Red jungle brand O.S.I. pro 80
Styrofoam board
Pins
Scalpels Fine Scientific tools, Foster City, CA 10000-10
Forceps Fine Scientific tools, Foster City, CA 11223-20
Vannas scissors Fine Scientific tools, Foster City, CA 15000-11
2 ml screw cap tubes Fisher Scientific, Hampton, NH 02-681-375
1 mm glass beads Bio Spec 11079110
Glass beads for spreading Sigma, St. Louis, MO 18406-500G
Petri plate Fisher Brand, Hampton, NH FB0875713
1.5 ml centrifuge tube Midsci, Valley Park, MO AVSS1700
50 ml centrifuge tube Corning Falcon, Corning, NY 352098
Test tubes Pyrex 9820
Glass Pipette Fisher Brand, Hampton, NH 13675K
Micro pipettes Sartorius Biohit, Göttingen, Germany m1000/m200/m20
Tips Genesee Scientific, San Diego, CA 24-150RS/24-412
Chemicals
Instant Ocean salts
phosphate buffered saline VWR Life Science, Radnor, PA K813-500ml
Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt Sigma, St. Louis, MO A5040
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside Sigma, St. Louis, MO 10651745001
Schiff’s reagent Sigma, St. Louis, MO 84655-250 mL
periodic acid Fisher Scientific, Hampton, NH 10450-60-9
Mucin from porcine stomach Sigma, St. Louis, MO M2378-100G
Bovine serum albumin Fisher Scientific, Hampton, NH 9046-46-8
Pierce 660nm Protein Assay Reagent Thermo, Waltham, MA 22660
LB medium
Trypton BD Biosciences, San Jose, CA 211705
Teast Extract BD Biosciences, San Jose, CA 212750
NACL Fisher Scientific, Hampton, NH BP358-212
Agar BD Biosciences, San Jose, CA 214010
TCBS Agar BD Biosciences, San Jose, CA 265020
DCLS Agar Sigma, St. Louis, MO 70135-500gm
Software
Microsoft office
Prism 5

References

  1. Harris, J. B., LaRocque, R. C., Qadri, F., Ryan, E. T., Calderwood, S. B. Cholera. The Lancet. 379 (9835), 2466-2476 (2012).
  2. Dutta, D., et al. Vibrio cholerae non-O1, non-O139 serogroups and cholera-like diarrhea, Kolkata, India. Emerging Infectious Diseases. 19 (3), 464-467 (2013).
  3. Huq, A., et al. Ecological relationships between Vibrio cholerae and planktonic crustacean copepods. Applied and Environmental Microbiology. 45 (1), 275-283 (1983).
  4. Halpern, M., Landsberg, O., Raats, D., Rosenberg, E. Culturable and VBNC Vibrio cholerae: interactions with chironomid egg masses and their bacterial population. Microbial Ecology. 53 (2), 285-293 (2007).
  5. Broza, M., Halpern, M. Pathogen reservoirs. Chironomid egg masses and Vibrio cholerae. Nature. 412 (6842), 40 (2001).
  6. Halpern, M., Izhaki, I. Fish as hosts of Vibrio cholerae. Frontiers in Microbiology. 8 (282), (2017).
  7. Senderovich, Y., Izhaki, I., Halpern, M. Fish as reservoirs and vectors of Vibrio cholerae. PLoS ONE. 5 (1), e8607 (2010).
  8. Traore, O., et al. Occurrence of Vibrio cholerae in fish and water from a reservoir and a neighboring channel in Ouagadougou, Burkina Faso. The Journal of Infection in Developing Countries. 8 (10), 1334-1338 (2014).
  9. Booth, L. V., Lang, D. A., Athersuch, R. Isolation of Vibrio cholerae non-01 from a Somerset farmworker and his tropical fish tank. Journal of Infection. 20 (1), 55-57 (1990).
  10. Torres-Vitela, M. A., et al. Incidence of Vibrio cholerae in fresh fish and ceviche in Guadalajara, Mexico. Journal of Food Protection. 60 (3), 237-241 (1997).
  11. Rowe, H. M., Withey, J. H., Neely, M. N. Zebrafish as a model for zoonotic aquatic pathogens. Developmental & Comparative Immunology. 46 (1), 96-107 (2014).
  12. Runft, D. L., et al. Zebrafish as a natural host model for Vibrio cholerae colonization and transmission. Applied and Environmental Microbiology. 80 (5), 1710-1717 (2014).
  13. Mitchell, K. C., Breen, P., Britton, S., Neely, M. N., Withey, J. H. Quantifying Vibrio cholerae enterotoxicity in a zebrafish infection model. Applied and Environmental Microbiology. , (2017).
  14. Klose, K. E. The suckling mouse model of cholera. Trends in Microbiology. 8 (4), 189-191 (2000).
  15. Formal, S. B., Kundel, D., Schneider, H., Kunevn, H., Sprinz, Studies with Vibrio cholerae in the ligated loop of the rabbit intestine. British Journal of Experimental Pathology. 42, 504-510 (1961).
  16. Williams, E. M., Dohadwalla, A. N., Dutta, N. K. Diarrhea and accumulation of intestinal fluid in infant rabbits infected with Vibrio cholerae in an isolated jejunal segment. The Journal of Infectious Diseases. 120 (6), 645-651 (1969).
  17. Spira, W. M., Sack, R. B., Froehlich, J. L. Simple adult rabbit model for Vibrio cholerae and enterotoxigenic Escherichia coli diarrhea. Infection and Immunity. 32 (2), 739-747 (1981).
  18. Ritchie, J. M., Rui, H., Bronson, R. T., Waldor, M. K. Back to the future: studying cholera pathogenesis using infant rabbits. mBio. 1 (1), (2010).
  19. Kilcoyne, M., Gerlach, J. Q., Farrell, M. P., Bhavanandan, V. P., Joshi, L. Periodic acid-Schiff’s reagent assay for carbohydrates in a microtiter plate format. Analytical Biochemistry. 416 (1), 18-26 (2011).
  20. Balaji, V., Sridharan, G., Jesudason, M. V. Cytotoxicity of non O1, non O139 Vibrios isolated from fresh water bodies in Vellore, south India. Indian Journal of Medical Research. 110, 155-159 (1999).
  21. Hasan, N. A., et al. Nontoxigenic Vibrio cholerae non-O1/O139 isolate from a case of human gastroenteritis in the U.S. Gulf Coast. Journal of Clinical Microbiology. 53 (1), 9-14 (2015).

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Cite This Article
Nag, D., Mitchell, K., Breen, P., Withey, J. H. Quantifying Vibrio cholerae Colonization and Diarrhea in the Adult Zebrafish Model. J. Vis. Exp. (137), e57767, doi:10.3791/57767 (2018).

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