Quantifier la colonisation de Vibrio cholerae et la diarrhée dans le modèle de poisson-zèbre adulte
Summary
Poisson zèbre est un naturel Vibrio cholerae hôte et peut être utilisé pour récapituler et d’étudier l’ensemble du cycle infectieux de la colonisation à la transmission. Ici, nous démontrons comment évaluer les niveaux de colonisation V. cholerae et quantifier la diarrhée chez le poisson zèbre.
Abstract
Vibrio cholerae est surtout connu comme l’agent infectieux qui provoque le choléra de maladie humaine. À l’extérieur de l’hôte humain, V. cholerae existe principalement dans le milieu aquatique, où elle interagit avec une variété d’espèces aquatiques supérieures. Vertébrés poissons sont connus pour être un environnement hôte et sont un réservoir potentiel V. cholerae dans la nature. V. cholerae et l’espèce de poisson téléostéen Danio rerio, communément appelé poisson-zèbre, originaires du sous-continent indien, ce qui suggère une interaction de longue date dans les milieux aquatiques. Poisson zèbre est un organisme modèle idéal pour l’étude de nombreux aspects de la biologie, y compris les maladies infectieuses. Poisson zèbre peut être facilement et rapidement colonisé par V. cholerae après exposition dans l’eau. Colonisation de l’intestin par V. cholerae entraîne la production de la diarrhée et l’excrétion de répliqué V. cholerae. Ces excrété la bactérie peut alors continuer à coloniser de nouveaux poissons hôtes. Ici, nous démontrons comment évaluer V. cholerae-colonisation de l’intestin dans le poisson-zèbre et comment quantifier V. cholerae-induite par le poisson-zèbre diarrhée. Le modèle de colonisation doit être utile pour les chercheurs qui étudient si les gènes d’intérêt peuvent être importants pour la colonisation de l’hôte et/ou pour la survie dans l’environnement. La quantification du poisson-zèbre diarrhée devrait être utile aux chercheurs qui étudient tout pathogène intestinale et qui sont intéressés à explorer le poisson-zèbre comme système modèle.
Introduction
Vibrio cholerae est une bactérie Gram-négatif aquatique qui provoque le choléra maladie humaine, mais aussi les diarrhées sporadiques1,2. V. cholerae se trouve dans l’environnement dans de nombreuses régions du globe, souvent associé à d’autres organismes aquatiques. Ces organismes associant incluent plancton, masses de œufs insectes, mollusques et poissons vertébrés espèces3,4,5,6,7. Plusieurs études ont isolé V. cholerae des voies intestinales des poissons dans les différentes zones géographiques7,8,9,10. La présence de V. cholerae chez les poissons indique que les poissons peut agir comme un réservoir environnemental. Poissons pourraient également être impliqués dans la transmission de la maladie à l’homme et de la propagation géographique de V. cholerae souches6.
Pour mieux comprendre comment V. cholerae interagit avec poissons, Danio rerio, mieux connu sous le nom de poisson-zèbre, a été développé comme un système modèle pour l’étude de V. choleraee11. Poisson zèbre sont originaires d’Asie du Sud, y compris la région de la baie du Bengale, qui est considérée comme le plus ancien réservoir de V. cholerae. Avant le premier début pandémie de choléra en 1817, choléra n’avait pas été porté à l’extérieur de ce qui est maintenant l’Inde et le Bangladesh. Par conséquent, poisson-zèbre et V. cholerae presque certainement sont associées entre elles sur des échelles de temps évolutif, suggérant que poisson zèbre sont une foule de V. cholerae dans le milieu naturel12.
Le modèle de poisson zèbre pour V. cholerae est simple à exécuter et peut être utilisé pour étudier l’ensemble du pathogène V. cholerae le cycle de vie. Poissons sont exposés à V. cholerae de baignade dans l’eau qui a été vaccinée avec un nombre connu de V. cholerae. En quelques heures, colonisation de l’intestin a lieu, suivi par la production de la diarrhée. Diarrhée est constitué de mucine, protéines, bactéries excrétées et autres contenus intestinaux. Le degré de la diarrhée peut être quantifié à l’aide de quelques simples mesures13. V. cholerae qui a été excrétés par les poissons infectés peut ensuite passer à infecter les poissons naïfs, complétant le cycle infectieux. Par conséquent, le modèle de poisson-zèbre récapitule les V. cholerae maladies humaines processus12,14.
Le plus fréquemment utilisé V. cholerae modèles animaux ont toujours été des souris et des lapins14,15,16,17,18. Ces modèles ont contribué à ajouter à notre connaissance de la pathogénèse de V. cholerae . Cependant, parce que les souris et les lapins ne sont pas naturelles V. cholerae hôtes, il y a des limites à quels aspects du cycle de vie V. cholerae peuvent être étudiés. La colonisation de V. cholerae des souris et des lapins nécessite généralement l’absence du microbiote intestinal ou un prétraitement avec des antibiotiques pour endommager le microbiote intestinal. Les deux modèles nécessitent soit de gavage d’introduire les bactéries du tube digestif ou de manipulation chirurgicale d’injecter directement les bactéries dans les intestins. Poisson zèbre ont un avantage car les poissons adultes avec un microbiote intestinal intact sont facilement colonisés et le processus infectieux se passe naturellement, sans aucune manipulation nécessaire.
Le présent travail montre l’utilisation du poisson-zèbre comme modèle à V. cholerae infection. L’infection, dissection, dénombrement des colonisateurs V. choleraeet la quantification de la diarrhée causée par V. cholerae sera décrit12,13. Ce modèle est susceptible d’être utile aux scientifiques intéressés dans le processus de la maladie de V. cholerae , tant dans la vie de V. cholerae environnementale.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le poisson-zèbre est un relativement nouveau modèle pour l’étude de V. cholerae mais est très prometteur pour la future découverte des aspects inconnus de V. cholerae biologie et pathogenèse11,12,13 . Le modèle de poisson-zèbre adulte a l’avantage d’être une fois naturelles V. cholerae hôte qui contient le microbiote intestinal intact, mature et un modèle environnemental. Inconvénient…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Merci à Melody Neely, Jon Allen, Abuaita de Bâle et Donna Runft pour leurs efforts pour contribuer à développer le modèle de poisson-zèbre. La recherche rapportée ici a été financée par le National Institute of Allergy et des maladies infectieuses de la National Institutes of Health, sous les numéros de prix R21AI095520 et R01AI127390 (pour Jeffrey H. Withey). Le contenu est la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement l’opinion officielle de la National Institutes of Health.
Materials
| Instrument | |||
| Shaker incubator | New Brunswick Scientific, Edison, NJ | Excella E25 | |
| Incubator | NUAIRE, Plymouth, MN | Auto Flow | |
| Spectrophotometer | Thermo, Waltham, MA | Geaesys 6 | |
| Vortex homogenizer | Minibeadbeater24 | 112011 | |
| Weighing Machine | Ohaus, Columbia, MD | Adventurer Pro | |
| Heat Stirer | Corning, Corning, NY | PC-420D | |
| Burner | |||
| automated colony counter | REVSCI | 120417B | |
| Materials | |||
| 400 ml glass beakers | Pyrex | ||
| perforated lids | Microtip holder with holes from tip box | ||
| disposable plastic spoons | Office Depot, Boca Raton, FL | D15-25-7008 | |
| Fish Tank System | Aquaneering, San Diego, CA | ||
| RO Water Purifier | Aqua FX | TK001 | |
| Fish net | Marina | ||
| fish food | Tetra fin | ||
| Brine Shrimp | Red jungle brand | O.S.I. pro 80 | |
| Styrofoam board | |||
| Pins | |||
| Scalpels | Fine Scientific tools, Foster City, CA | 10000-10 | |
| Forceps | Fine Scientific tools, Foster City, CA | 11223-20 | |
| Vannas scissors | Fine Scientific tools, Foster City, CA | 15000-11 | |
| 2 ml screw cap tubes | Fisher Scientific, Hampton, NH | 02-681-375 | |
| 1 mm glass beads | Bio Spec | 11079110 | |
| Glass beads for spreading | Sigma, St. Louis, MO | 18406-500G | |
| Petri plate | Fisher Brand, Hampton, NH | FB0875713 | |
| 1.5 ml centrifuge tube | Midsci, Valley Park, MO | AVSS1700 | |
| 50 ml centrifuge tube | Corning Falcon, Corning, NY | 352098 | |
| Test tubes | Pyrex | 9820 | |
| Glass Pipette | Fisher Brand, Hampton, NH | 13675K | |
| Micro pipettes | Sartorius Biohit, Göttingen, Germany | m1000/m200/m20 | |
| Tips | Genesee Scientific, San Diego, CA | 24-150RS/24-412 | |
| Chemicals | |||
| Instant Ocean salts | |||
| phosphate buffered saline | VWR Life Science, Radnor, PA | K813-500ml | |
| Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt | Sigma, St. Louis, MO | A5040 | |
| 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside | Sigma, St. Louis, MO | 10651745001 | |
| Schiff’s reagent | Sigma, St. Louis, MO | 84655-250 mL | |
| periodic acid | Fisher Scientific, Hampton, NH | 10450-60-9 | |
| Mucin from porcine stomach | Sigma, St. Louis, MO | M2378-100G | |
| Bovine serum albumin | Fisher Scientific, Hampton, NH | 9046-46-8 | |
| Pierce 660nm Protein Assay Reagent | Thermo, Waltham, MA | 22660 | |
| LB medium | |||
| Trypton | BD Biosciences, San Jose, CA | 211705 | |
| Teast Extract | BD Biosciences, San Jose, CA | 212750 | |
| NACL | Fisher Scientific, Hampton, NH | BP358-212 | |
| Agar | BD Biosciences, San Jose, CA | 214010 | |
| TCBS Agar | BD Biosciences, San Jose, CA | 265020 | |
| DCLS Agar | Sigma, St. Louis, MO | 70135-500gm | |
| Software | |||
| Microsoft office | |||
| Prism 5 |
References
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