Summary

Quantificare la colonizzazione di Vibrio cholerae e diarrea nel modello Zebrafish adulto

Published: July 12, 2018
doi:

Summary

Zebrafish sono un naturale Vibrio cholerae host e può essere utilizzato per riassumere e studiare l’intero ciclo infettivo dalla colonizzazione alla trasmissione. Qui, dimostriamo come valutare i livelli di colonizzazione di V. cholerae e quantificare la diarrea in zebrafish.

Abstract

Vibrio cholerae è meglio conosciuto come l’agente infettivo che causa il colera malattia umana. All’esterno l’ospite umano, V. cholerae esiste principalmente per l’ambiente acquatico, dove interagisce con una varietà di specie acquatiche superiori. Pesci vertebrati sono noti per essere un host ambientale e sono un potenziale serbatoio di V. cholerae in natura. V. cholerae e le specie di pesci teleostei Danio rerio, comunemente note come zebrafish, hanno origine dal subcontinente indiano, suggerendo una lunga interazione in ambienti acquatici. Zebrafish sono un organismo modello ideale per studiare molti aspetti della biologia, tra cui le malattie infettive. Zebrafish può essere facilmente e rapidamente colonizzato da V. cholerae dopo l’esposizione in acqua. Colonizzazione intestinale da V. cholerae conduce alla produzione di diarrea e l’escrezione di replicata V. cholerae. Questi escreti batteri possono quindi andare a colonizzare nuovi host di pesce. Qui, dimostriamo come valutare V. cholerae-colonizzazione intestinale in zebrafish e come quantificare V. cholerae-indotto diarrea di zebrafish. Il modello di colonizzazione dovrebbe essere utile per i ricercatori che stanno studiando se geni di interesse possono essere importanti per la colonizzazione di host e/o per la sopravvivenza dell’ambiente. La quantificazione di zebrafish diarrea dovrebbe essere utile ai ricercatori di studiare qualsiasi agente patogeno intestinale che sono interessati ad esplorare zebrafish come sistema modello.

Introduction

Vibrio cholerae è un batterio gram-negativo, acquatico che causa il colera malattia umana così come diarrea sporadica1,2. V. cholerae è trovato nell’ambiente in molte aree del globo, spesso associato con altri organismi acquatici. Questi organismi associazione includono plancton, ovature di insetti, crostacei e pesci vertebrati specie3,4,5,6,7. Parecchi studi hanno isolato V. cholerae da tratti intestinali di pesce in diverse aree geografiche7,8,9,10. La presenza di V. cholerae in pesce indica che il pesce può agire come un serbatoio ambientale. Pesce potrebbe essere implicato anche nella trasmissione della malattia agli esseri umani e nella diffusione geografica di V. cholerae ceppi6.

Per comprendere meglio come V. cholerae interagisce con pesce, Danio rerio, meglio conosciuto come pesce zebra, è stato sviluppato come sistema modello per lo studio di V. colerae11. Zebrafish sono nativi di Asia del sud, compresa la regione del Golfo del Bengala, che è pensata per essere il primo serbatoio di V. cholerae. Prima del primo inizio pandemia colera nel 1817, il colera non era stato segnalato di fuori di quello che oggi è India e Bangladesh. Di conseguenza, zebrafish e V. cholerae quasi certamente associati con a vicenda su scale di tempo evolutivo, suggerendo che zebrafish sono un host V. cholerae nell’ ambiente naturale12.

Il modello di zebrafish per V. cholerae è semplice da eseguire e può essere usato per studiare l’intero patogeno V. cholerae ciclo di vita. Pesci sono esposti a V. cholerae di bagnarsi in acqua che è stato inoculato con un numero noto di V. cholerae. Entro poche ore, si svolge colonizzazione intestinale, seguita dalla produzione di diarrea. Diarrea è costituito da mucina, proteine, batteri escreti e altri contenuti intestinali. Il grado di diarrea può essere quantificato utilizzando pochi semplici misurazioni13. V. cholerae che è stata escreta dai pesci infettati può quindi andare per infettare pesce ingenuo, completando il ciclo infettivo. Di conseguenza, il modello di zebrafish ricapitola le V. cholerae malattia umana processo12,14.

Il più delle volte usato V. cholerae modelli animali sono stati storicamente topi e conigli14,15,16,17,18. Questi modelli sono stati strumentali in aggiunta alla nostra conoscenza della patogenesi di V. cholerae . Tuttavia, poiché topi e conigli non sono naturali V. cholerae padroni di casa, ci sono limitazioni a quali aspetti del ciclo di vita di V. cholerae possono essere studiati. La colonizzazione di V. cholerae di topi e conigli richiede in genere l’assenza di microbiota intestinale o un pretrattamento con gli antibiotici per danneggiare il microbiota intestinale. Entrambi i modelli richiedono o sonda gastrica per introdurre i batteri al tratto digestivo o manipolazione chirurgica per iniettare direttamente i batteri nell’intestino. Zebrafish hanno un vantaggio in quanto pesce adulto con un microbiota intestinale intatto sono prontamente colonizzati e il processo infettivo avviene naturalmente, senza alcuna manipolazione necessaria.

Il lavoro attuale dimostra l’utilizzo di zebrafish come un modello di infezione da V. cholerae . L’infezione, la dissezione, enumerazione di colonizzare V. choleraee la quantificazione di diarrea causata da V. cholerae sarà descritto12,13. Questo modello rischia di essere utile agli scienziati interessati sia nel processo di malattia V. cholerae e il lifestyle di V. cholerae ambientale.

Protocol

Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dal istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) della Wayne State University. Questo metodo è stato descritto in Runft et al. 12 1. determinazione dei livelli di colonizzazione intestinale Nota: Colonizzazione intestinale è la metrica più utile nel modello zebrafish come può essere utilizzato per confrontare la relativa idoneità dei vari ceppi di V. cholerae o gli ef…

Representative Results

V. cholerae colonizzazione dei tratti intestinali zebrafish Per fornire un esempio dei livelli tipici colonizzazione che osserviamo, abbiamo inoculato 5 x 106 CFU di EL Tor V. cholerae ceppo pandemico N16961 in 200 mL di acqua in un becher contenente diversi zebrafish. Dopo 6 h di infezione, il pesce sono stato lavato in acqua dolce e trasferito in un becher di 200 mL di acqua in autoclave infezione com…

Discussion

Zebrafish è un relativamente nuovo modello per lo studio di V. cholerae ma molto promettente per la scoperta di futura aspetti inediti di V. cholerae biologia e patogenesi11,12,13 . Il modello di zebrafish adulto ha i vantaggi di essere sia un naturale V. cholerae host che contiene il microbiota intestinale intatto, maturo e un modello dell’ambiente. Svantaggi del modello sono che i due fattori di vir…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Grazie alla melodia Neely, Jon Allen, Basilea Abuaita e Donna Runft per il loro impegno nel contribuire a sviluppare il modello di zebrafish. La ricerca segnalata qui è stata sostenuta dal National Institute of Allergy e malattie infettive dei National Institutes of Health, sotto numeri del premio R21AI095520 e R01AI127390 (per Jeffrey H. Withey). Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale del National Institutes of Health.

Materials

Instrument
Shaker incubator New Brunswick Scientific, Edison, NJ Excella E25
Incubator NUAIRE, Plymouth, MN Auto Flow
Spectrophotometer Thermo, Waltham, MA Geaesys 6
Vortex homogenizer Minibeadbeater24 112011
Weighing Machine Ohaus, Columbia, MD Adventurer Pro
Heat Stirer Corning, Corning, NY PC-420D
Burner
automated colony counter REVSCI 120417B
Materials
400 ml glass beakers Pyrex
perforated lids Microtip holder with holes from tip box
disposable plastic spoons Office Depot, Boca Raton, FL D15-25-7008
Fish Tank System Aquaneering, San Diego, CA
RO Water Purifier Aqua FX TK001
Fish net Marina
fish food Tetra fin
Brine Shrimp Red jungle brand O.S.I. pro 80
Styrofoam board
Pins
Scalpels Fine Scientific tools, Foster City, CA 10000-10
Forceps Fine Scientific tools, Foster City, CA 11223-20
Vannas scissors Fine Scientific tools, Foster City, CA 15000-11
2 ml screw cap tubes Fisher Scientific, Hampton, NH 02-681-375
1 mm glass beads Bio Spec 11079110
Glass beads for spreading Sigma, St. Louis, MO 18406-500G
Petri plate Fisher Brand, Hampton, NH FB0875713
1.5 ml centrifuge tube Midsci, Valley Park, MO AVSS1700
50 ml centrifuge tube Corning Falcon, Corning, NY 352098
Test tubes Pyrex 9820
Glass Pipette Fisher Brand, Hampton, NH 13675K
Micro pipettes Sartorius Biohit, Göttingen, Germany m1000/m200/m20
Tips Genesee Scientific, San Diego, CA 24-150RS/24-412
Chemicals
Instant Ocean salts
phosphate buffered saline VWR Life Science, Radnor, PA K813-500ml
Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt Sigma, St. Louis, MO A5040
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside Sigma, St. Louis, MO 10651745001
Schiff’s reagent Sigma, St. Louis, MO 84655-250 mL
periodic acid Fisher Scientific, Hampton, NH 10450-60-9
Mucin from porcine stomach Sigma, St. Louis, MO M2378-100G
Bovine serum albumin Fisher Scientific, Hampton, NH 9046-46-8
Pierce 660nm Protein Assay Reagent Thermo, Waltham, MA 22660
LB medium
Trypton BD Biosciences, San Jose, CA 211705
Teast Extract BD Biosciences, San Jose, CA 212750
NACL Fisher Scientific, Hampton, NH BP358-212
Agar BD Biosciences, San Jose, CA 214010
TCBS Agar BD Biosciences, San Jose, CA 265020
DCLS Agar Sigma, St. Louis, MO 70135-500gm
Software
Microsoft office
Prism 5

References

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Cite This Article
Nag, D., Mitchell, K., Breen, P., Withey, J. H. Quantifying Vibrio cholerae Colonization and Diarrhea in the Adult Zebrafish Model. J. Vis. Exp. (137), e57767, doi:10.3791/57767 (2018).

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