Amacımız mitokondrial disfonksiyon kanser hastalarında yorgunluk ile ilişkili değerlendirmek için pratik bir protokol geliştirmekti. Bu yenilikçi protokol döneminde klinik kullanımı içeren yalnızca standart flebotomi ve Temel Laboratuvar işlemleri için optimize edilmiştir.
Yorgunluk bir ortak ve çoğu kanser hastaları etkileyen durum zayıflatıcı olduğunu. Bugüne kadar bu durumun şiddetini ölçmek için objektif yorgunluk kalır kötü hiçbir tanı ile karakterize sınayın. Burada PBMCs yorgun kanser hastalarına toplanan mitokondriyal işlev değerlendirmek için en iyi duruma getirilmiş bir yöntemi açıklanmaktadır. Bir kompakt ekstraselüler akı sistemi ve solunum inhibitörleri sıralı enjeksiyon kullanma, biz PBMC mitokondrial fonksiyonel durum bazal mitokondrial solunum, yedek solunum kapasitesi ve açıklar enerji fenotip ölçerek muayene strese yanıt vermek için tercih edilen enerji yolu. Taze PBMCs klinik ayarı standart flebotomi kullanarak kolayca kullanılabilir. Bu protokol için açıklanan tüm tahlil karmaşık biyokimyasal tekniklerin katılımı olmadan 4 saatten az bir süre içinde tamamlanabilir. Ayrıca, tekrarlanabilir veri almak için gerekli olan bir normalleştirme yöntemi açıklanmaktadır. Sunulan basit yordamı ve normalleştirme Yöntem aynı hasta ve potansiyel tedavisinin etkileri değerlendirmek için zaman puan arasında karşılaştırılabilir tekrarlanabilir veri nesil tekrarlanan örnek toplama için izin vermek.
Yorgunluk, kanser hastaları1yaşam kalitesi üzerinde olumsuz bir etkisi vardır yaygın ve üzücü bir durumdur. Bu tarihe kanser yorgunluk kötü tanımlanmış kalır ve sadece öznel hastalar2tarafından raporlama üzerinde dayanır. Bu nedenle, yorgunluk klinik ayarı3,4objektif olarak niteleyen bir kolayca uyarlanabilir tanılama laboratuvar testi tanımlamak için acil bir ihtiyaç vardır.
Mitokondri disfonksiyon, dahil olmak üzere birden çok temel mekanizmaları yorgunluk5neden önerilen. Mitokondri hücresel enerji ihtiyacı ile Oksidatif fosforilasyon, % 95’i sağlayan elektrik santrali organelleri ve kalsiyum sinyal, apoptozis, bağışıklık sinyal ve diğer hücre içi sinyal olaylar6 düzenlenmesi önemli bir rol oynamak . Buna göre Engelli mitokondriyal bioenergetics ve enerji üretim hatalarını yorgunluk için katkıda bulunabilir. Bu hipotezi destekleyen, önceki çalışmalarda kronik yorgunluk sendromu7olan hastalarda mitokondriyal DNA’da mutasyonlar gözlemledim. Olup merkezi sinir sistemi veya iskelet kasları8,9gibi periferik doku içinde yorgunluk patofizyolojik kökeni yatıyor belirsiz kalırken işte şu anda doğru değerlendirmek için doğrudan Yöntem Mitokondrial disfonksiyon canlı, respiring hücrelerdeki yorgunluk ile ilgili.
Mitokondriyal işlev çalışmaya periferik kan mononükleer hücreler (PBMCs) kullanarak birçok avantaj sunar. İlk olarak, PBMCs standart flebotomi kullanarak klinik ortamda kullanılabilir ve hızlı bir şekilde temel laboratuvar teknikleri kullanarak ayrılmış olabilir. İkinci olarak, kan diğer dokulara kas biyopsisi gibi toplama daha az invaziv oluşur. Böylece, kan örnekleri aynı hastadan art arda tedavisinin etkileri boyuna değerlendirilmesi kolaylaştırır zaman içinde toplanabilir. İlginçtir, PBMCs mitokondriyal işlevde de bir hayvan modeli10böbrek mitokondrial durumu ile ilişkili olduğu ortaya çıktı. Ayrıca, bağışıklık hücre mitokondri farklı hastalık koşulları11,12altında sistemik değişiklikleri algılamak için bir proxy olarak kullanılmaya başlandı. Mitokondri bağışıklık hücreleri dolaşan içinde özellikle bağışıklık işlevlerindeki değişikliklere duyarlı ve bağışıklık sitokinler13,14,15gibi moleküller sinyal vardır. Örneğin, PBMCs hastalarda akut romatizmal inflamatuar hastalıklar ile yüksek temel oksijen tüketimi14sergi gözlenmiştir. Buna ek olarak, oksijen tüketimi sepsis16dahil olmak üzere sistemik inflamatuar koşullar ile hastalardan izole PBMCs düşürüldü. İnflamatuar koşullar altında serbest radikaller tarafından işlevsiz mitokondri üretilen daha fazla yüksek oksidatif stres ve uzun süreli iltihap17için katkıda bulunabilir. Mitokondri oksidatif stres gibi enerji üretiminde de merkezi rol yorgunluk kanser hastaların 13‘ te çalışmak için bir proxy olarak mitokondriyal işlev kullanarak potansiyel yardımcı programı öneriyor.
Mitokondriyal işlev inceleyerek önceki çalışmalarda kullanılan biyokimyasal teknikleri, mitokondrial membran potansiyeli ölçüm veya klinik ayarı5‘, kolayca adapte olmayabilir belirli hücre popülasyonlarının yalıtım 14,18. Son yıllarda, hücre dışı akı deneyleri gelişimi araştırmacılar için kolayca izin verdi ve doğru bir şekilde yanıt olarak solunum inhibitörleri19,20 otomatik enjeksiyon oksijen tüketim oranını (OCR) değişiklikleri incelemek , 21 , 22. ancak, bu çalışmaların en belirli hücre tipleri için tasarlanmıştır ve yüksek üretilen iş büyüklüğündeki bir klinik ortamda geçerli olmayabilir. Bu makale, klinik kullanım için mitokondriyal işlev incelenmesi için en iyi duruma getirilmiş bir protokol açıklar.
Yorgunluk kanser hastalarında iyi tanımlanmış değil veya1ile karakterize zayıflatıcı bir durumdur. Yorgunluk tanısında tamamen öznel raporlama kullanır ve hiçbir geçerli tanılama standart ya da tedavi için bu durum, büyük ölçüde onun pathobiology2anlayış eksikliği nedeniyle. Kanser hastalarında yorgunluk temel önerilen mekanizmaları, mitokondriyal işlev bozukluğu en tedavi amaçlı targetable yollar biridir. Bu nedenle, biz proaktif hasta yorgun…
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışmada bölme, Intramural araştırmaya, Ulusal Enstitüsü Hemşirelik araştırma NIH, Bethesda, Maryland, tam olarak desteklenir.
CPT Mononuclear Cells Preparation Tube | BD Biosciences | 362761 | For isolating PBMCs following phlebotomy |
RPMI-1640 | Corning | 10-040 | For making growth media for PBMCs |
Fetal bovine serum (FBS) | Corning | 35-010-CV | For making growth media for PBMCs |
Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | For making growth media for PBMCs |
Cell-Tak | Corning | 354240 | Cell and Tissue adhesive solution; allows suspension cells to adhere to the surface |
Seahorse XF Calibrant Solution | Agilent | 103059-000 | For hydrating cartridges |
XFp Fluxpak (miniplates and sensor cartridges) | Agilent | 103022-100 | Contains XFp cell culture miniplates and sensor cartridges |
XF base media | Agilent | 103335-100 | For making XF assay media |
45% cell culture D-(+)-Glucose solution | Corning | 25-037-CI | For making XF assay media |
Sodium pyruvate solution | Corning | 25-000-CI | For making XF assay media |
L-glutamine solution | ThermoFisher | 25030081 | For making XF assay media |
Seahorse XFp Mito Stress Test Kit | Agilent | 103010-100 | Contains oligomycin, FCCP, antimycin A/rotenone |
CyQUANT Direct Cell Proliferation Assay | ThermoFisher | C35011 | For quantification of live cells and data normalization |
Seahorse XFp Analyzer | Agilent | S7802AEA | For measuring mitochondrial function in live cells |
Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader (or any instrument that can quantify fluorescent cells in a plate) | BioTek | BTCYT5PV | For quantification of live cells and data normalization |