המטרה שלנו הייתה לפתח פרוטוקול מעשית להערכת תפקוד מיטוכונדריאלי המשויך עייפות אצל חולי סרטן. פרוטוקול זה חדשני ממוטב רגיל רק שימוש קליני מעורבים עם דם ורידי ונהלים מעבדה בסיסית.
עייפות היא משותפת, מתישה מצב זה משפיע על חולי סרטן. עד כה, עייפות נשאר גרוע מאופיין עם אבחון לא מבחן אובייקטיבי מודדים את חומרת המצב הזה. כאן נתאר שיטת אופטימיזציה להערכת תפקוד מיטוכונדריאלי של PBMCs שנאסף חולי סרטן עייף. באמצעות מערכת קומפקטית השטף חוץ-תאית הזרקה רציפים של מעכבי נשימה, נבחנו המצב התפקודי מיטוכונדריאלי PBMC על ידי מדידת נשימה מיטוכונדריאלי הבזליים לקיבולת בדרכי הנשימה, אנרגיה פנוטיפ, המתאר מסלול אנרגיה מועדף להגיב על הלחץ. PBMCs טריים זמינים בהגדרת קליניים באמצעות דם ורידי רגיל. וזמינותו כולו שמתואר פרוטוקול זה יכולה להסתיים תוך פחות מ 4 שעות ללא המעורבות של טכניקות הביוכימי מורכבים. בנוסף, אנו מתארים שיטה לנרמול הדרוש להשגת לשחזור נתונים. השיטות הליך ונורמליזציה פשוטה הציג מאפשרים איסוף הדגימה חוזרות ונשנות מן החולה באותו הדור לשחזור נתונים ניתן להשוואה בין נקודות זמן כדי להעריך את תופעות הטיפול האפשריות.
עייפות היא מצב נפוץ ומצערת זה יש השפעה שלילית על איכות החיים של חולי סרטן1. מועד זה, סרטן נשאר גרוע מוגדר ועייפות מסתמך רק על דיווח סובייקטיבי על-ידי חולים2. לכן, יש צורך דחוף לזהות ניסוי מעבדה אבחון להתאמה בקלות לאפיין באופן אובייקטיבי עייפות3,בקביעת קליני4.
מנגנונים כבסיס מרובות, כולל תפקוד המיטוכונדריה, הוצעו כדי לגרום לעייפות5. המיטוכונדריה הם organelles תחנת כוח, מתן 95% צרכי האנרגיה התאית באמצעות זרחון חמצוני, ולשחק תפקיד חשוב סידן איתות אפופטוזיס, המערכת החיסונית איתות, ויסות תאיים אחרים איתות האירועים6 . בהתאם לכך, ביואנרגיה מיטוכונדריאלי לקוי, פגמים בייצור אנרגיה עשויים לתרום עייפות. תמיכה השערה זו, מחקרים קודמים מקיימות מוטציות ב- DNA מיטוכונדריאלי בחולים עם תסמונת התשישות הכרונית7. אמנם עדיין לא ברור אם מקור pathophysiological עייפות טמון בתוך מערכת העצבים המרכזית או רקמות היקפיים, כגון שרירי השלד8,9, יש כיום אין שיטה ישירה להעריך במדויק תפקוד לקוי של מיטוכונדריאלי הקשורים עייפות בתאים חיים, respiring.
באמצעות תאי תאי דם היקפיים (PBMCs) ללמוד פונקציה מיטוכונדריאלי מציע מספר יתרונות. ראשית, PBMCs זמינים בהגדרת קליניים באמצעות דם ורידי רגיל, ניתן לבודד במהירות באמצעות טכניקות מעבדה בסיסית. שנית, איסוף דם הוא פחות פולשניים איסוף לרקמות אחרות כגון ביופסיה של השריר. לפיכך, דגימות דם ניתן לאסוף מן המטופל אותו שוב ושוב לאורך זמן, אשר מקלה על הערכת האורך של השפעות הטיפול. מעניין, פונקציית מיטוכונדריאלי PBMCs הופיע טוב בקורלציה עם כליות מצב מיטוכונדריאלי במודל חיה10. יתר על כן, תא החיסון המיטוכונדריה שימשו כמדד לזיהוי שינויים מערכתית תחת מחלות שונות בתנאים11,12. המיטוכונדריה במחזור תאים חיסוניים הם רגישים לשינויי פונקציות החיסונית במיוחד ואת המערכת החיסונית איתות מולקולות כגון ציטוקינים13,14,15. לדוגמה, זה נצפתה PBMCs של חולים עם מחלות דלקתיות פרקים חריפה התערוכה צריכת חמצן בסיסית גבוהה14. לעומת זאת, צריכת חמצן צומצם ב PBMCs מבודדים מחולים עם התנאים דלקתית מערכתית כולל אלח דם16. תחת תנאים דלקתיים, רדיקלים חופשיים המיוצר על ידי המיטוכונדריה לקוי עשוי נוספת לתרום סטרס חמצוני גבוהות ו דלקת ממושכת17. התפקיד המרכזי של המיטוכונדריה בהפקת אנרגיה, כמו גם כמו סטרס חמצוני מציע השירות פוטנציאל של שימוש ב- function מיטוכונדריאלי כמדד ללמוד עייפות חולי סרטן 13.
מחקרים קודמים בחינת תפקוד מיטוכונדריאלי מנוצל טכניקות הביוכימי, מדידת פוטנציאל ממברנה מיטוכונדריאלי או בידוד של אוכלוסיות תאים מסוים עשוי להיות לא ברצון וישימה בקביעת קליני5, 14,18. בשנים האחרונות, ההתפתחות של מבחני חוץ-תאית השטף איפשר לחוקרים בקלות ולבחון באופן מדויק שינויי קצב צריכת החמצן (OCR) בתגובה זריקות אוטומטיות של מעכבי נשימה19,20 , 21 , 22. עם זאת, רוב המחקרים הללו תוכננו עבור סוגי תאים ספציפיים ולא בפורמט גדול תפוקה גבוהה ניתן החלים בסביבה קלינית. כתב יד זה, אנו מתארים פרוטוקול ממוטבת לבחינת תפקוד מיטוכונדריאלי לשימוש קליני.
עייפות אצל חולי סרטן היא מחלה מתישה אינה מוגדרת היטב או מאופיין1. אבחון של עייפות כולו מתבסס על דיווח סובייקטיבי, אין תקן הנוכחי אבחון או טיפול עבור תנאי זה, בעיקר בשל חוסר ההבנה שלו pathobiology2. מנגנוני המוצעת שבבסיס עייפות אצל חולי סרטן, ליקוי בתפקוד מיטוכונדריאלי הו…
The authors have nothing to disclose.
מחקר זה נתמך באופן מלא על ידי חלוקה של מגזר המחקר של במכון הלאומי סיעוד למחקר של NIH, בת’סדה, מרילנד.
CPT Mononuclear Cells Preparation Tube | BD Biosciences | 362761 | For isolating PBMCs following phlebotomy |
RPMI-1640 | Corning | 10-040 | For making growth media for PBMCs |
Fetal bovine serum (FBS) | Corning | 35-010-CV | For making growth media for PBMCs |
Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | For making growth media for PBMCs |
Cell-Tak | Corning | 354240 | Cell and Tissue adhesive solution; allows suspension cells to adhere to the surface |
Seahorse XF Calibrant Solution | Agilent | 103059-000 | For hydrating cartridges |
XFp Fluxpak (miniplates and sensor cartridges) | Agilent | 103022-100 | Contains XFp cell culture miniplates and sensor cartridges |
XF base media | Agilent | 103335-100 | For making XF assay media |
45% cell culture D-(+)-Glucose solution | Corning | 25-037-CI | For making XF assay media |
Sodium pyruvate solution | Corning | 25-000-CI | For making XF assay media |
L-glutamine solution | ThermoFisher | 25030081 | For making XF assay media |
Seahorse XFp Mito Stress Test Kit | Agilent | 103010-100 | Contains oligomycin, FCCP, antimycin A/rotenone |
CyQUANT Direct Cell Proliferation Assay | ThermoFisher | C35011 | For quantification of live cells and data normalization |
Seahorse XFp Analyzer | Agilent | S7802AEA | For measuring mitochondrial function in live cells |
Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader (or any instrument that can quantify fluorescent cells in a plate) | BioTek | BTCYT5PV | For quantification of live cells and data normalization |