Notre objectif était d’élaborer un protocole pratique pour évaluer le dysfonctionnement mitochondrial associé de fatigue chez les patients atteints de cancer. Ce protocole novateur est optimisé pour l’usage clinique impliquant seulement standard phlébotomie et procédures de laboratoire de base.
La fatigue est un commun et invalidante maladie qui affecte la plupart des patients de cancer. A ce jour, reste de fatigue mal caractérisé avec aucun diagnostic test pour mesurer objectivement la gravité de cette affection. Nous décrivons ici une méthode optimisée pour évaluer la fonction mitochondriale de PBMC provenant de patients atteints de cancer fatigué. Avec un système compact de flux extracellulaire et l’injection séquentielle des inhibiteurs respiratoires, nous avons examiné état fonctionnel mitochondrial PBMC par mesurer la respiration mitochondriale basale, rechange capacité respiratoire et le phénotype de l’énergie, qui décrit la voie de l’énergie préférée à réagir au stress. PBMC fraîches est facilement disponibles en milieu clinique à l’aide de phlébotomie standard. Le test complet décrit dans le présent protocole peut être complété en moins de 4 heures sans l’implication des techniques biochimiques complexes. En outre, les auteurs décrivent une méthode de normalisation qui est nécessaire pour l’obtention de données reproductibles. Les procédure ainsi que la normalisation des méthodes simples présentées permettent de prélèvement d’échantillons répétés du même patient et générer des données reproductibles qui peuvent être comparées entre points dans le temps d’évaluer les effets potentiels du traitement.
La fatigue est une condition pénible et répandue qui a un impact négatif sur la qualité de vie des patients de cancer1. À ce jour, fatigue cancer reste mal défini et s’appuie uniquement sur les rapports subjectifs patients2. Par conséquent, il y a un besoin urgent d’identifier un test de laboratoire de diagnostic facilement adaptable pour caractériser objectivement la fatigue dans le contexte clinique3,4.
Plusieurs mécanismes sous-jacents, y compris le dysfonctionnement des mitochondries, ont été proposées pour causer fatigue5. Les mitochondries sont les organites de la centrale, qui fournit 95 % des besoins en énergie cellulaire par l’intermédiaire de la phosphorylation oxydative et jouent un rôle important dans la signalisation calcique, apoptose, signalisation immunitaire et régulation de la signalisation intracellulaire événements6 . En conséquence, bioénergétique mitochondriale avec facultés affaiblies et les défauts de production d’énergie peuvent contribuer à la fatigue. Faveur de cette hypothèse, des études antérieures ont observé des mutations de l’ADN mitochondrial chez les patients atteints de syndrome de fatigue chronique7. Alors qu’on ne sait toujours pas si l’origine physiopathologique de la fatigue se situe dans le système nerveux central ou des tissus périphériques, tels que les muscles squelettiques8,9, il n’y a actuellement aucune méthode directe d’évaluer avec précision dysfonctionnement mitochondrial lié à la fatigue dans les cellules vivantes, respiration.
À l’aide de cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC) pour étudier la fonction mitochondriale offre plusieurs avantages. Tout d’abord, PBMC est facilement disponibles en milieu clinique à l’aide de phlébotomie standard et peut être isolée rapidement en utilisant des techniques de laboratoire de base. Deuxièmement, prélèvement de sang est moins invasif que la collecte d’autres tissus comme une biopsie musculaire. Ainsi, les échantillons de sang peuvent être recueillies chez le même patient à plusieurs reprises au fil du temps, ce qui facilite une évaluation longitudinale des effets du traitement. Fait intéressant, la fonction mitochondriale chez PBMC semblait être bien corrélée à statut mitochondrial rein dans un modèle animal de10. En outre, les mitochondries des cellules immunitaires ont servi en tant que proxy pour détecter des changements systémiques sous différentes maladies conditions11,12. Les mitochondries dans les cellules immunitaires circulantes sont particulièrement sensibles aux changements dans les fonctions immunitaires et immunitaire, signalisation des molécules telles que les cytokines13,14,15. Par exemple, on a observé que les PBMC de patients atteints de maladies inflammatoires rhumatismales aiguës pièce base élevées d’oxygène consommation14. En revanche, la consommation d’oxygène est réduite chez PBMC isolées de patients avec des conditions inflammatoires systémiques, y compris septicémie16. Dans des conditions inflammatoires, radicaux libres produits par les mitochondries dysfonctionnelles peuvent contribuer davantage à élevé de stress oxydatif et l’inflammation prolongée de17. Le rôle central des mitochondries dans la production d’énergie ainsi que dans le stress oxydatif suggère l’utilité potentielle de l’utilisation de la fonction mitochondriale comme un proxy pour l’étude de fatigue chez les patients de cancer 13.
Des études antérieures examinant la fonction mitochondriale utilisé des techniques biochimiques, mesure de potentiel de membrane mitochondrial ou l’isolement des populations de cellules spécifiques qui peuvent ne pas être facilement adaptable dans le contexte clinique5, 14,,18. Ces dernières années, le développement des analyses de flux extracellulaire a permis aux chercheurs de facilement et avec précision examiner les changements dans les taux de consommation d’oxygène (OCR) en réponse à des injections automatisées d’inhibiteurs respiratoire19,20 , 21 , 22. Toutefois, la plupart de ces études est conçue pour des types spécifiques de cellules et le grand format haut débit n’est peut-être pas applicable en milieu clinique. Dans ce manuscrit, les auteurs décrivent un protocole optimisé pour l’examen de la fonction mitochondriale pour l’usage clinique.
Fatigue chez les patients atteints de cancer est une maladie débilitante qui n’est pas bien défini ou caractérisé1. Diagnostic de fatigue repose entièrement sur la déclaration subjective et il n’y a aucune norme actuelle de diagnostic ou traitement pour cette condition, en grande partie dû au manque de compréhension de sa pathologie2. Des mécanismes proposés qui sous-tendent la fatigue chez les patients cancéreux, altération de la fonction mitochondriale est…
The authors have nothing to disclose.
Cette étude est entièrement pris en charge par la Division de la recherche intra-muros de la National Institute of Nursing Research des NIH, Bethesda, Maryland.
CPT Mononuclear Cells Preparation Tube | BD Biosciences | 362761 | For isolating PBMCs following phlebotomy |
RPMI-1640 | Corning | 10-040 | For making growth media for PBMCs |
Fetal bovine serum (FBS) | Corning | 35-010-CV | For making growth media for PBMCs |
Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | For making growth media for PBMCs |
Cell-Tak | Corning | 354240 | Cell and Tissue adhesive solution; allows suspension cells to adhere to the surface |
Seahorse XF Calibrant Solution | Agilent | 103059-000 | For hydrating cartridges |
XFp Fluxpak (miniplates and sensor cartridges) | Agilent | 103022-100 | Contains XFp cell culture miniplates and sensor cartridges |
XF base media | Agilent | 103335-100 | For making XF assay media |
45% cell culture D-(+)-Glucose solution | Corning | 25-037-CI | For making XF assay media |
Sodium pyruvate solution | Corning | 25-000-CI | For making XF assay media |
L-glutamine solution | ThermoFisher | 25030081 | For making XF assay media |
Seahorse XFp Mito Stress Test Kit | Agilent | 103010-100 | Contains oligomycin, FCCP, antimycin A/rotenone |
CyQUANT Direct Cell Proliferation Assay | ThermoFisher | C35011 | For quantification of live cells and data normalization |
Seahorse XFp Analyzer | Agilent | S7802AEA | For measuring mitochondrial function in live cells |
Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader (or any instrument that can quantify fluorescent cells in a plate) | BioTek | BTCYT5PV | For quantification of live cells and data normalization |