Summary

Свет лист микроскопии для трехмерной визуализации иммунных клеток человека

Published: June 13, 2018
doi:

Summary

Здесь мы представляем протокол визуализировать клетки иммунной системы, внедренные в матрицу трехмерного (3D) коллагена, с помощью микроскопии свет лист. Этот протокол также рассматриваются как отслеживать миграции клеток в 3D. Этот протокол может использоваться для других типов клеток подвеска в матрице 3D.

Abstract

В естественных условиях, активации, распространением и функции всех иммунокомпетентные клетки происходят в трехмерных (3D) среде, например в лимфатических узлах или тканей. До даты большинство систем в vitro полагаются на двухмерный (2D) поверхности, такие как культура клетки пластин или coverslips. Чтобы оптимально мимических физиологических условиях в пробиркемы используем простой 3D коллагеновой матрицы. Коллаген является одним из основных компонентов внеклеточного матрикса (ECM) и широко используется в качестве 3D матрицы. Для 3D визуализации, недавно разработанных свет лист микроскопии технологии (также называется один самолет освещения микроскопии) отличен с высокой скоростью, большие глубины, низкий отбеливания и photocytotoxicity. Кроме того свет лист микроскопии является особенно выгодным для долгосрочных измерений. Здесь мы описываем оптимизированный протокол как создать и обработать человека иммунные клетки, например первичного человека цитотоксических Т-лимфоцитов (CTL) и природные убийца (НК) клетки в 3D коллагеновой матрицы для использования с свет лист микроскопии для живых клеток и фиксированных выборок. Процедура приобретения изображений и анализа миграции клеток представлены. Особое внимание уделяется выделить важные шаги и факторы для пробоподготовки и анализа данных. Этот протокол может использоваться для других типов клеток подвеска в 3D коллагеновой матрицы и не ограничивается иммунных клеток.

Introduction

Большинство знаний о миграции клеток происходит от 2D экспериментов1,2,3, которая обычно проводится в стеклянные или пластмассовые поверхности культуры/изображений блюдо. Однако, в большинстве случаев, физиологические сценарий требует 3D микроокружения, в котором внеклеточного матрикса (ECM) играет решающую роль. ECM не только обеспечивает эфирное 3D структуры для поддержания надлежащего клеток морфологии, но также предлагает выживания сигналов или направленного подсказки для оптимального функционирования многих клеток4,5 . Таким образом 3D окружающей среды требуется для лучшего определения клеточных функций и поведения в среде, лучше отражающие физиологических контекст.

В человеческом теле большинство клеток особенно иммунных клеток, оказывают свои функции согласно сценарию 3D. К примеру активированные Т-клетки сторожевые тканей, поиск для клеток-мишеней, наивно T-клетки мигрируют через лимфатические узлы в поисках их родственных антиген представляющих клеток, во время которых режим миграции и машины адаптированы к соответствующим внеклеточного окружающей среды3,6,7. Геля 3D коллаген широко использовался как устоявшихся и хорошо изученных 3D клеточной культуры системы8,9,10. Наши предыдущие работы показывает, что основной лимфоцитах человека мобильны и мигрируют со средней скоростью около 4,8 мкм/мин в 0,25% коллагена основе матрицы11. Перестановка цитоскелета играет ключевую роль в миграции клеток12. Накопление доказательств показывает, что лимфоциты не применяется только один режим миграции еще можно переключаться между определенное поведение миграции в зависимости от местоположения, микроокружение, цитокины, эозинофилов градиенты, и внеклеточных сигналов какой мотив мигрирующие поведение в 3различными способами.

Для надежного анализа иммунных клеток функции и поведение, например, миграция, формирования протрузии или везикулярный транспорт, это большое преимущество, чтобы иметь возможность получить изображения в относительно больших объемах 3D быстрым и надежным способом. Для 3D визуализации, недавно разработанных свет лист микроскопии технологии (также называется один самолет освещения микроскопии) предлагает удовлетворительного решения13,14. Во время визуализации приобретения, тонколистовой статический свет генерируется для освещения образца. Таким образом, на плоскости фокуса большой площади может быть освещен одновременно не затрагивая-плоскости клетки. Эта функция позволяет высокой скоростью с резко сниженным отбеливания и photocytotoxicity. В этой статье мы описываем, как визуализировать первичного человека иммунные клетки, с помощью микроскопии свет листа и как для анализа миграции в сценарии 3D.

Protocol

Исследования, проведенные для этого исследования с человеческого материала (лейкоцитов сокращения системы камер от человеческой крови доноров) уполномоченным местным этике (декларация от 16.4.2015 (84/15; Профессор д -р Rettig-Stürmer)) и соответствующие руководящие принципы. 1. Подго?…

Representative Results

Формирования протрузии во время миграции клеток T является весьма динамичный процесс, который является актина зависимых. Чтобы визуализировать выступ формирование первичных человеческих CTL, мы временно transfected mEGFP плавленый белка на этикетке Цитоскелет актина в CTL как …

Discussion

Большинство анализов в vitro осуществляется на 2D поверхности, например в культуре клеток тарелки, чашки Петри или на coverslips, тогда как в естественных условиях клетки, особенно иммунные клетки, опыт работы главным образом 3D микроокружения. Новые свидетельства показывает, что мигр?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы благодарим институт клинической Hemostaseology и трансфузионной медицины для предоставления донорской крови; Кармен Hässig и кора Ходжа за отличную техническую помощь. Мы благодарим Jens Реттиг (Университет Саарленд) для модифицированных pMAX вектора, Roland Ведлих-Söldner (Университет Мюнстер) для оригинальной конструкции рубиново-LifeAct и Кристиан Юнкер (Университет Саарленд) для генерации LifeAct-mEGFP конструкции. Этот проект финансировался 1027 Sonderforschungsbereich (проект A2 до B.Q.) и 894 (проект A1 м.г.). Микроскоп свет лист был финансируемых DFG (GZ: INST 256/4 19-1 FUGG).

Materials

Fibricol, bovine collagen solution Advanced Biomatrix  #5133-20ML Collagen matrix
0.5 M NaOH Solution Merck 1091381000 for neutralizing Fibricol solution
Ultra-Low melting agarose Affymetrix 32821-10GM Sample preparation in low c[Col]
Dynabeads Untouched Human CD8 T Cells Kit Thermo Fisher 11348D Isolation of primary human CD8+ T cells from PBMC
Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 for T Cell Expansion and Activation Thermo Fisher 11132D Activation of CTL populations
Human recombinant interleukin-2 Thermo Fisher PHC0023 Stimulation of cultured CTL
P3 Primary solution kit Lonza V4XP-30XX Transfection
α-PFN1 antibody, rabbit, IgG Abcam ab124904 IF
Alexa Fluor 633 Phalloidin Thermo Fisher A22284 IF
CellMask Orange Plasma membrane Stain Thermo Fisher C10045 Fluorescent cell label
Tween 20 Sigma P1379-250mL IF
Triton X-100 Eurobio 018774 IF
DPBS Dulbecco's phopsphate buffered saline Thermo Fisher 14190250 IF
Bovine serum albumin Sigma A9418-100G IF
Goat α Rabbit 568, IgG, rabbit Thermo Fisher A-11011 IF
Lightsheet Z.1 (Light-sheet microscopy) Zeiss N.A.
Cell culture hood Thermo Fisher HeraSafe KS
Cell culture incubator HERACell 150i  Thermo Fisher N.A.
Centrifuge 5418 and 5452 Eppendorf N.A.
Pippettes Eppendorf 3123000039, 3123000020, 3123000063
Pippette tips VWR 89079-444, 89079-436, 89079-452 
15 mL tubes Sarstedt  62.554.002
Capillaries 50 µL VWR (Brand) 613-3373 Zeiss LSFM sample preparation
Plunger for capillaries VWR (Brand) BRND701934 "Stamps with Teflon tip" LSFM sample preparation
MColorPhast pH stips Merck 1095430001 to test pH of neutralized Fibricol
BD Plastipak 1mL syringes BD Z230723 ALDRICH Alternative sample preparation
Modeling clay (Hasbro Play-Doh A5417EU7) Play-Doh N.A.
Imaris file converter Bitplane available at http://www.bitplane.com  Convert imaging files to Imaris file format
Imaris 8.1.2 (MeasurementPro, Track, Vantage) Bitplane available at http://www.bitplane.com  Analysis of 3D and 4D imaging data

References

  1. Decaestecker, C., Debeir, O., Van Ham, P., Kiss, R. Can anti-migratory drugs be screened in vitro? A review of 2D and 3D assays for the quantitative analysis of cell migration. Med Res Rev. 27 (2), 149-176 (2007).
  2. Doyle, A. D., Petrie, R. J., Kutys, M. L., Yamada, K. M. Dimensions in cell migration. Curr Opin Cell Biol. 25 (5), 642-649 (2013).
  3. Krummel, M. F., Bartumeus, F., Gerard, A. T cell migration, search strategies and mechanisms. Nat Rev Immunol. 16 (3), 193-201 (2016).
  4. Entschladen, F., et al. Analysis methods of human cell migration. Exp Cell Res. 307 (2), 418-426 (2005).
  5. Meredith, J. E., Fazeli, B., Schwartz, M. A. The extracellular matrix as a cell survival factor. Mol Biol Cell. 4 (9), 953-961 (1993).
  6. Friedl, P., Wolf, K. Plasticity of cell migration: a multiscale tuning model. J Cell Biol. 188 (1), 11-19 (2010).
  7. Ridley, A. J., et al. Cell migration: integrating signals from front to back. Science. 302 (5651), 1704-1709 (2003).
  8. Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: experimental models of mammalian biology and disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (10), 647-664 (2014).
  9. Ravi, M., Paramesh, V., Kaviya, S. R., Anuradha, E., Solomon, F. D. 3D cell culture systems: advantages and applications. J Cell Physiol. 230 (1), 16-26 (2015).
  10. Fang, Y., Eglen, R. M. Three-Dimensional Cell Cultures in Drug Discovery and Development. SLAS Discov. 22 (5), 456-472 (2017).
  11. Schoppmeyer, R., et al. Human profilin 1 is a negative regulator of CTL mediated cell-killing and migration. Eur J Immunol. 47 (9), 1562-1572 (2017).
  12. Mogilner, A., Oster, G. Cell motility driven by actin polymerization. Biophys J. 71 (6), 3030-3045 (1996).
  13. Santi, P. A. Light sheet fluorescence microscopy: a review. J Histochem Cytochem. 59 (2), 129-138 (2011).
  14. Power, R. M., Huisken, J. A guide to light-sheet fluorescence microscopy for multiscale imaging. Nat Methods. 14 (4), 360-373 (2017).
  15. Zhou, X., et al. Bystander cells enhance NK cytotoxic efficiency by reducing search time. Sci Rep. 7, 44357 (2017).
  16. Lammermann, T., et al. Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing. Nature. 453 (7191), 51-55 (2008).
  17. Petrie, R. J., Yamada, K. M. At the leading edge of three-dimensional cell migration. J Cell Sci. 125 (Pt 24), 5917-5926 (2012).
  18. Imamura, Y., et al. Comparison of 2D- and 3D-culture models as drug-testing platforms in breast cancer). Oncol Rep. 33 (4), 1837-1843 (2015).
  19. Lee, J. M., et al. A three-dimensional microenvironment alters protein expression and chemosensitivity of epithelial ovarian cancer cells in vitro. Lab Invest. 93 (5), 528-542 (2013).
  20. Luca, A. C., et al. Impact of the 3D microenvironment on phenotype, gene expression, and EGFR inhibition of colorectal cancer cell lines. PLoS One. 8 (3), e59689 (2013).
  21. Jemielita, M., Taormina, M. J., Delaurier, A., Kimmel, C. B., Parthasarathy, R. Comparing phototoxicity during the development of a zebrafish craniofacial bone using confocal and light sheet fluorescence microscopy techniques. J Biophotonics. 6 (11-12), 920-928 (2013).
  22. Graf, B. W., Boppart, S. A. Imaging and analysis of three-dimensional cell culture models. Methods Mol Biol. 591, 211-227 (2010).
  23. Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nat Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
  24. Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).
  25. Verveer, P. J., et al. High-resolution three-dimensional imaging of large specimens with light sheet-based microscopy. Nat Methods. 4 (4), 311-313 (2007).
  26. Truong, T. V., Supatto, W., Koos, D. S., Choi, J. M., Fraser, S. E. Deep and fast live imaging with two-photon scanned light-sheet microscopy. Nat Methods. 8 (9), 757-760 (2011).
  27. Haycock, J. W. 3D cell culture: a review of current approaches and techniques. Methods Mol Biol. 695, 1-15 (2011).
  28. Mestas, J., Hughes, C. C. Of mice and not men: differences between mouse and human immunology. J Immunol. 172 (5), 2731-2738 (2004).

Play Video

Cite This Article
Schoppmeyer, R., Zhao, R., Hoth, M., Qu, B. Light-sheet Microscopy for Three-dimensional Visualization of Human Immune Cells. J. Vis. Exp. (136), e57651, doi:10.3791/57651 (2018).

View Video