Summary

Microscopia di luce-foglio per visualizzazione tridimensionale delle cellule immuni umane

Published: June 13, 2018
doi:

Summary

Qui, presentiamo un protocollo per visualizzare le cellule immunitarie incorporate in una matrice di collagene (3D) tridimensionale utilizzando la microscopia a luce-foglio. Questo protocollo elabora anche come tenere traccia di migrazione cellulare in 3D. Questo protocollo può essere impiegato per altri tipi di cellule in sospensione nella matrice 3D.

Abstract

In vivo, l’attivazione, proliferazione e funzione delle cellule immuni tutti si verificano in un ambiente tridimensionale (3D), per esempio nei linfonodi o tessuti. Fino a data, la maggior parte dei sistemi in vitro si basano su superfici bidimensionali (2D), come piastre di coltura cellulare o vetrini coprioggetti. A condizioni fisiologiche in modo ottimale mimare in vitro, utilizziamo una matrice di collagene 3D semplice. Il collagene è uno dei principali componenti della matrice extracellulare (ECM) ed è stato ampiamente utilizzato per costituire matrici 3D. Per l’imaging 3D, la tecnologia sviluppata di recente la microscopia luce-foglio (noto anche come microscopia di illuminazione su un unico piano) è dotata di acquisizione ad alta velocità, profondità di penetrazione grande, candeggio basso e fotocitotossicità. Inoltre, la microscopia luce-foglio è particolarmente vantaggiosa per misurazioni a lungo termine. Qui descriviamo un protocollo ottimizzato come impostare e gestire le cellule immuni umane, ad esempio primario umani linfociti T citotossici (CTL) e cellule natural killer (NK) nella matrice collagene 3D per l’utilizzo con la microscopia di luce-foglio per l’imaging di cellule vive e campioni fissati. La procedura di acquisizione e analisi di migrazione delle cellule delle immagini sono presentati. Un’attenzione particolare è data per evidenziare i passaggi critici e fattori per la preparazione dei campioni e analisi dei dati. Questo protocollo può essere impiegato per altri tipi di cellule in sospensione in una matrice di collagene 3D e non è limitato alle cellule immuni.

Introduction

La maggior parte delle conoscenze sulla migrazione di cellule proviene da 2D esperimenti1,2,3, che normalmente si svolgono in una superficie in vetro o in plastica di un cultura/imaging piatto. Tuttavia, uno scenario fisiologico richiede, nella maggior parte dei casi, un microambiente 3D, in cui la matrice extracellulare (ECM) svolge un ruolo determinante. ECM non solo fornisce l’essenziale struttura 3D per mantenere la morfologia cellulare corretto, ma offre anche segnali di sopravvivenza o direzionale spunti per un funzionamento ottimale di molte cellule4,5 . Pertanto, è necessario per identificare meglio le funzioni cellulari e comportamento in un ambiente che meglio riflette il contesto fisiologico un ambiente 3D.

Nel corpo umano, la maggior parte delle cellule soprattutto le cellule immuni, esercitano le loro funzioni nell’ambito di uno scenario 3D. Per esempio, cellule di T attivate pattugliano tessuti alla ricerca di cellule bersaglio, le cellule T naive migrano attraverso i linfonodi in cerca di loro cellule presentanti l’antigene cognate durante il quale le modalità di migrazione e i macchinari sono adattati ai corrispondenti extracellulare ambiente3,6,7. Il gel di collagene 3D è stato ampiamente usato come un cellulare 3D ben consolidata e ben caratterizzati cultura sistema8,9,10. Il nostro lavoro precedente dimostra che linfociti umani primari sono estremamente mobili e la migrazione a una velocità media di circa 4,8 µm/min in una matrice a base di collagene di 0,25%11. Riarrangiamento del citoscheletro svolge un ruolo chiave nella migrazione cellulare12. Raccogliendo la prova dimostra che i linfociti non si applicano solo una singola modalità di migrazione ancora possono passare di certo comportamento di migrazione a seconda della posizione, microambiente, citochine, gradienti chemiotattici e segnali extracellulari quali tune il comportamento migratorio in modi diversi 3.

Per analizzare in modo affidabile le funzioni delle cellule immuni e comportamento, ad esempio, migrazione, formazione di protrusione o trasporto vescicolare, è di grande vantaggio di essere in grado di acquisire immagini in 3D relativamente grandi volumi in modo veloce e affidabile. Per l’imaging 3D, la tecnologia sviluppata di recente la microscopia luce-foglio (noto anche come microscopia di illuminazione su un unico piano) offre una soluzione soddisfacente13,14. Durante l’acquisizione di imaging, un sottile foglio di luce statico viene generato per illuminare il campione. In questo modo, sul piano di messa a fuoco, una vasta area possa essere illuminata contemporaneamente senza intaccare le cellule fuori piano. Questa funzionalità consente una velocità di acquisizione elevata con un candeggio drasticamente ridotto e la fotocitotossicità. In questo articolo, descriviamo come visualizzare cellule immuni umane primarie utilizzando la microscopia a luce-foglio e come analizzare la migrazione in uno scenario 3D.

Protocol

Ricerca effettuata per questo studio con il materiale umano (alloggiamenti di sistema del leucocita riduzione dai donatori di sangue umano) è autorizzata dal comitato etico locale (dichiarazione da 16.4.2015 (84/15; Prof. Dr. Rettig-Stürmer)) e segue le linee guida corrispondenti. 1. preparazione della soluzione neutralizzata collagene (500 µ l) Trasferire 400 µ l di soluzione di riserva refrigerata collagene (10,4 mg/mL) in una provetta sterile 1,5 mL sotto il cofano di cultura …

Representative Results

Formazione di protrusione durante la migrazione delle cellule T è un processo altamente dinamico, che è dipendente di actina. Per visualizzare la formazione di protrusione di CTL umano primario, transfected transitoriamente una proteina mEGFP fusa per etichettare il citoscheletro di actina in CTL come descritto prima delle11. Un giorno dopo trasfezione, le cellule sono state incorporate nella matrice di collagene. Serie di immagini sono state acquisite ogni 40 s …

Discussion

La maggior parte in vitro le analisi sono effettuata su una superficie 2D, ad esempio in piastre di coltura cellulare, capsule di Petri o sulle lamelle, considerando che in vivo le cellule, soprattutto le cellule immuni, esperienza principalmente un microambiente 3D. La prova emergente indica che modelli di migrazione delle cellule immuni differiscono tra 2D e 3D scenari17. Inoltre, i profili di espressione delle cellule del tumore sono differenti in 2D e 3D-in coltura di tessuti…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ringraziamo l’Istituto di clinica Hemostaseology e medicina trasfusionale per la fornitura di sangue del donatore; Carmen Hässig e Cora Hoxha per l’eccellente assistenza tecnica. Ringraziamo Jens Rettig (Saarland University) per il vettore di pMAX modificate, Roland Wedlich-Soldner (Università di Muenster) per il costrutto originale LifeAct-Ruby e Christian Junker (Saarland University) per generare il costrutto LifeAct-mEGFP. Questo progetto è stato finanziato da 1027 Sonderforschungsbereich (progetto A2 a B.Q.) e 894 (progetto A1 a M.H.). Il microscopio di luce-foglio è stato finanziato dalla DFG (GZ: FUGG 19-1 INST 256/4).

Materials

Fibricol, bovine collagen solution Advanced Biomatrix  #5133-20ML Collagen matrix
0.5 M NaOH Solution Merck 1091381000 for neutralizing Fibricol solution
Ultra-Low melting agarose Affymetrix 32821-10GM Sample preparation in low c[Col]
Dynabeads Untouched Human CD8 T Cells Kit Thermo Fisher 11348D Isolation of primary human CD8+ T cells from PBMC
Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 for T Cell Expansion and Activation Thermo Fisher 11132D Activation of CTL populations
Human recombinant interleukin-2 Thermo Fisher PHC0023 Stimulation of cultured CTL
P3 Primary solution kit Lonza V4XP-30XX Transfection
α-PFN1 antibody, rabbit, IgG Abcam ab124904 IF
Alexa Fluor 633 Phalloidin Thermo Fisher A22284 IF
CellMask Orange Plasma membrane Stain Thermo Fisher C10045 Fluorescent cell label
Tween 20 Sigma P1379-250mL IF
Triton X-100 Eurobio 018774 IF
DPBS Dulbecco's phopsphate buffered saline Thermo Fisher 14190250 IF
Bovine serum albumin Sigma A9418-100G IF
Goat α Rabbit 568, IgG, rabbit Thermo Fisher A-11011 IF
Lightsheet Z.1 (Light-sheet microscopy) Zeiss N.A.
Cell culture hood Thermo Fisher HeraSafe KS
Cell culture incubator HERACell 150i  Thermo Fisher N.A.
Centrifuge 5418 and 5452 Eppendorf N.A.
Pippettes Eppendorf 3123000039, 3123000020, 3123000063
Pippette tips VWR 89079-444, 89079-436, 89079-452 
15 mL tubes Sarstedt  62.554.002
Capillaries 50 µL VWR (Brand) 613-3373 Zeiss LSFM sample preparation
Plunger for capillaries VWR (Brand) BRND701934 "Stamps with Teflon tip" LSFM sample preparation
MColorPhast pH stips Merck 1095430001 to test pH of neutralized Fibricol
BD Plastipak 1mL syringes BD Z230723 ALDRICH Alternative sample preparation
Modeling clay (Hasbro Play-Doh A5417EU7) Play-Doh N.A.
Imaris file converter Bitplane available at http://www.bitplane.com  Convert imaging files to Imaris file format
Imaris 8.1.2 (MeasurementPro, Track, Vantage) Bitplane available at http://www.bitplane.com  Analysis of 3D and 4D imaging data

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Cite This Article
Schoppmeyer, R., Zhao, R., Hoth, M., Qu, B. Light-sheet Microscopy for Three-dimensional Visualization of Human Immune Cells. J. Vis. Exp. (136), e57651, doi:10.3791/57651 (2018).

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