Summary

人間の免疫細胞の三次元可視化のための光シート顕微鏡

Published: June 13, 2018
doi:

Summary

ここでは、光シート顕微鏡を用いた三次元 (3 D) コラーゲン マトリックスに埋め込まれた免疫細胞を可視化するためのプロトコルを提案する.このプロトコルはまた、3 D の細胞の移動を追跡する方法を詳しく説明します。3 D マトリックスの懸濁細胞の他のタイプのこのプロトコルを用いることができます。

Abstract

生体内で、活性化、増殖、およびすべての免疫細胞の機能は、例えばリンパ節の組織の三次元 (3 D) 環境で発生します。最新では、ほとんどの生体外でシステムは細胞培養プレートか coverslips などの 2 次元 (2 D) 表面に依存します。生理学的な条件を最適な模倣の in vitro、単純な 3 D コラーゲン マトリックスを駆使します。コラーゲンは細胞外マトリックス (ECM) の主要なコンポーネントの 1 つと広く 3 D マトリックスを構成するために使用されています。3 D イメージングの (単一の平面照明顕微鏡とも呼ばれる) 最近開発された光シート顕微鏡技術は高い集録速度、大きな浸透深さ、低漂白、photocytotoxicity と紹介されています。さらに、光シート顕微鏡は長期計測のため特に有利です。ここで最適化されたプロトコルは、セットアップ、人間の免疫細胞、例えば主なひと細胞傷害性 T リンパ球 (CTL) を処理する方法を記述してナチュラル キラー (NK) 細胞の生細胞イメージングのための光シート顕微鏡用 3 D コラーゲン マトリックス ・固定サンプル。細胞遊走の画像取得と解析の手順が掲載されています。特定焦点は、重要なステップと試料調製及びデータ解析のための要因を強調表示に与えられます。このプロトコルは、3 D コラーゲン マトリックスの懸濁細胞の他のタイプのために用いることができるし、免疫細胞に制限されていません。

Introduction

移行についてほとんど知識細胞に由来する 2 D 実験1,2,3、通常ガラスまたは文化/イメージングのプラスチック表面で実施された料理。しかし、生理学的なシナリオを必要とするほとんどのケースで 3 D 微小環境、細胞外マトリックス (ECM) が決定的な役割を果たしています。ECM は、適切な細胞の形態を維持するために 3 D 構造エッセンシャルを提供するだけでなく、生存信号または多く細胞45の最適な機能の方向性の手がかりを提供しています。したがって、3 D 環境が良い細胞機能および生理学的なコンテキストを反映してより良い環境での動作を識別するために必要です。

人間の体内では、ほとんど細胞免疫細胞特には 3 D シナリオの下でその機能を発揮します。たとえば、活性化 T 細胞は標的細胞を探して組織をパトロール、ナイーブ T 細胞はリンパ節の検索中に移行モードと機械に対応する細胞外適応している同種の抗原提示の細胞に移行環境3,6,7。3次元コラーゲンゲルは、よく確立され、よ特徴付けられた 3 D の細胞培養システム8,9,10として広く使用されています。我々 の以前の仕事は、一次ヒトリンパ高度なモバイルが 0.25% コラーゲン ベースの行列11約 4.8 μ m/分の平均速度で移行を示しています。細胞骨格の再編は、細胞移行12のキーの役割を果たしています。細胞外シグナルが曲とリンパ球のみのシングル モードの移行は適用されませんまだ場所、微小環境、サイトカイン、走化性の勾配に応じて特定の移行動作を切り替えることができますを示しています証拠を蓄積、別の方法3の回遊行動。

免疫細胞機能や動作、たとえば、移行、突出部形成または小胞輸送を確実に分析するには、高速かつ信頼性の高い方法で比較的大きな 3 D ボリューム内の画像を取得することができるため大きな利点です。3 D イメージングのため (1 つの平面照明顕微鏡とも呼ばれる) 最近開発された光シート顕微鏡技術は、満足のいく解決13,14を提供しています。買収、イメージング、中にサンプルを照らす照明板が薄く静的が生成されます。これで、焦点面大面積は、平面を細胞に影響を与えずに同時に照らされることができます。この機能により、大幅に削減漂白と photocytotoxicity 高速です。本稿では、光シート顕微鏡を用いたプライマリひと免疫細胞を可視化する方法と 3 D のシナリオで移行を分析する方法について説明します。

Protocol

ひと由来の材料 (ヒトの血液ドナーからの白血球減少システム室) と本研究の遂行の研究が倫理委員会 (16.4.2015 (84/15; から宣言によって承認されて教授博士レッティグ Stürmer))、対応するガイドラインに従います。 1. 中和コラーゲン溶液の調製 (500 μ L) 細胞文化のフードの下で滅菌 1.5 mL チューブに冷やしたコラーゲン原液 (10.4 mg/mL) の 400 μ L を転送します。徐々 ?…

Representative Results

T 細胞の移行中に突出部形成は、アクチン依存である非常にダイナミックなプロセスです。主なヒト CTL の突起形成を視覚化するには、一過性11の前に、の前述の CTL におけるアクチン細胞骨格のラベルに mEGFP 融合タンパク質を transfected しました。トランスフェクション後、1 日、細胞は、コラーゲン マトリックスに埋め込まれていた。画像のスタッ…

Discussion

ほとんどの in vitroアッセイは 2 D 画面で、たとえば細胞培養プレート、シャーレや coverslips、生体内で細胞、免疫細胞特に経験ほとんど 3次元微小環境に対し行われます。出現の証拠は、2 D と 3 D のシナリオ17で免疫細胞の移行パターンが異なることを示しています。さらに、腫瘍細胞の発現も 2 D と 3 D 培養組織18,19<su…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

研究所臨床 Hemostaseology と輸血ドナー血液を提供するために感謝します。カルメン Hässig と優秀な技術的なヘルプのコーラ Hoxha。LifeAct mEGFP 構造を生成するありがとう修正 pMAX ベクトルのイェンス レッティグ (ザールラント州大学)、ローランド Wedlich-日ソールドナー (ミュンスター大学) 元 LifeAct ルビー構築のため、キリスト教のユンカー (ザールラント州大学)。このプロジェクトは、Sonderforschungsbereich 1027 (プロジェクト A2 ベクレル) と 894 (プロジェクト A1 か) によって賄われていた。DFG によって資金が供給された光シート顕微鏡 (GZ: INST 256/4 19 1 FUGG)。

Materials

Fibricol, bovine collagen solution Advanced Biomatrix  #5133-20ML Collagen matrix
0.5 M NaOH Solution Merck 1091381000 for neutralizing Fibricol solution
Ultra-Low melting agarose Affymetrix 32821-10GM Sample preparation in low c[Col]
Dynabeads Untouched Human CD8 T Cells Kit Thermo Fisher 11348D Isolation of primary human CD8+ T cells from PBMC
Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 for T Cell Expansion and Activation Thermo Fisher 11132D Activation of CTL populations
Human recombinant interleukin-2 Thermo Fisher PHC0023 Stimulation of cultured CTL
P3 Primary solution kit Lonza V4XP-30XX Transfection
α-PFN1 antibody, rabbit, IgG Abcam ab124904 IF
Alexa Fluor 633 Phalloidin Thermo Fisher A22284 IF
CellMask Orange Plasma membrane Stain Thermo Fisher C10045 Fluorescent cell label
Tween 20 Sigma P1379-250mL IF
Triton X-100 Eurobio 018774 IF
DPBS Dulbecco's phopsphate buffered saline Thermo Fisher 14190250 IF
Bovine serum albumin Sigma A9418-100G IF
Goat α Rabbit 568, IgG, rabbit Thermo Fisher A-11011 IF
Lightsheet Z.1 (Light-sheet microscopy) Zeiss N.A.
Cell culture hood Thermo Fisher HeraSafe KS
Cell culture incubator HERACell 150i  Thermo Fisher N.A.
Centrifuge 5418 and 5452 Eppendorf N.A.
Pippettes Eppendorf 3123000039, 3123000020, 3123000063
Pippette tips VWR 89079-444, 89079-436, 89079-452 
15 mL tubes Sarstedt  62.554.002
Capillaries 50 µL VWR (Brand) 613-3373 Zeiss LSFM sample preparation
Plunger for capillaries VWR (Brand) BRND701934 "Stamps with Teflon tip" LSFM sample preparation
MColorPhast pH stips Merck 1095430001 to test pH of neutralized Fibricol
BD Plastipak 1mL syringes BD Z230723 ALDRICH Alternative sample preparation
Modeling clay (Hasbro Play-Doh A5417EU7) Play-Doh N.A.
Imaris file converter Bitplane available at http://www.bitplane.com  Convert imaging files to Imaris file format
Imaris 8.1.2 (MeasurementPro, Track, Vantage) Bitplane available at http://www.bitplane.com  Analysis of 3D and 4D imaging data

References

  1. Decaestecker, C., Debeir, O., Van Ham, P., Kiss, R. Can anti-migratory drugs be screened in vitro? A review of 2D and 3D assays for the quantitative analysis of cell migration. Med Res Rev. 27 (2), 149-176 (2007).
  2. Doyle, A. D., Petrie, R. J., Kutys, M. L., Yamada, K. M. Dimensions in cell migration. Curr Opin Cell Biol. 25 (5), 642-649 (2013).
  3. Krummel, M. F., Bartumeus, F., Gerard, A. T cell migration, search strategies and mechanisms. Nat Rev Immunol. 16 (3), 193-201 (2016).
  4. Entschladen, F., et al. Analysis methods of human cell migration. Exp Cell Res. 307 (2), 418-426 (2005).
  5. Meredith, J. E., Fazeli, B., Schwartz, M. A. The extracellular matrix as a cell survival factor. Mol Biol Cell. 4 (9), 953-961 (1993).
  6. Friedl, P., Wolf, K. Plasticity of cell migration: a multiscale tuning model. J Cell Biol. 188 (1), 11-19 (2010).
  7. Ridley, A. J., et al. Cell migration: integrating signals from front to back. Science. 302 (5651), 1704-1709 (2003).
  8. Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: experimental models of mammalian biology and disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (10), 647-664 (2014).
  9. Ravi, M., Paramesh, V., Kaviya, S. R., Anuradha, E., Solomon, F. D. 3D cell culture systems: advantages and applications. J Cell Physiol. 230 (1), 16-26 (2015).
  10. Fang, Y., Eglen, R. M. Three-Dimensional Cell Cultures in Drug Discovery and Development. SLAS Discov. 22 (5), 456-472 (2017).
  11. Schoppmeyer, R., et al. Human profilin 1 is a negative regulator of CTL mediated cell-killing and migration. Eur J Immunol. 47 (9), 1562-1572 (2017).
  12. Mogilner, A., Oster, G. Cell motility driven by actin polymerization. Biophys J. 71 (6), 3030-3045 (1996).
  13. Santi, P. A. Light sheet fluorescence microscopy: a review. J Histochem Cytochem. 59 (2), 129-138 (2011).
  14. Power, R. M., Huisken, J. A guide to light-sheet fluorescence microscopy for multiscale imaging. Nat Methods. 14 (4), 360-373 (2017).
  15. Zhou, X., et al. Bystander cells enhance NK cytotoxic efficiency by reducing search time. Sci Rep. 7, 44357 (2017).
  16. Lammermann, T., et al. Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing. Nature. 453 (7191), 51-55 (2008).
  17. Petrie, R. J., Yamada, K. M. At the leading edge of three-dimensional cell migration. J Cell Sci. 125 (Pt 24), 5917-5926 (2012).
  18. Imamura, Y., et al. Comparison of 2D- and 3D-culture models as drug-testing platforms in breast cancer). Oncol Rep. 33 (4), 1837-1843 (2015).
  19. Lee, J. M., et al. A three-dimensional microenvironment alters protein expression and chemosensitivity of epithelial ovarian cancer cells in vitro. Lab Invest. 93 (5), 528-542 (2013).
  20. Luca, A. C., et al. Impact of the 3D microenvironment on phenotype, gene expression, and EGFR inhibition of colorectal cancer cell lines. PLoS One. 8 (3), e59689 (2013).
  21. Jemielita, M., Taormina, M. J., Delaurier, A., Kimmel, C. B., Parthasarathy, R. Comparing phototoxicity during the development of a zebrafish craniofacial bone using confocal and light sheet fluorescence microscopy techniques. J Biophotonics. 6 (11-12), 920-928 (2013).
  22. Graf, B. W., Boppart, S. A. Imaging and analysis of three-dimensional cell culture models. Methods Mol Biol. 591, 211-227 (2010).
  23. Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nat Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
  24. Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).
  25. Verveer, P. J., et al. High-resolution three-dimensional imaging of large specimens with light sheet-based microscopy. Nat Methods. 4 (4), 311-313 (2007).
  26. Truong, T. V., Supatto, W., Koos, D. S., Choi, J. M., Fraser, S. E. Deep and fast live imaging with two-photon scanned light-sheet microscopy. Nat Methods. 8 (9), 757-760 (2011).
  27. Haycock, J. W. 3D cell culture: a review of current approaches and techniques. Methods Mol Biol. 695, 1-15 (2011).
  28. Mestas, J., Hughes, C. C. Of mice and not men: differences between mouse and human immunology. J Immunol. 172 (5), 2731-2738 (2004).

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Cite This Article
Schoppmeyer, R., Zhao, R., Hoth, M., Qu, B. Light-sheet Microscopy for Three-dimensional Visualization of Human Immune Cells. J. Vis. Exp. (136), e57651, doi:10.3791/57651 (2018).

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