Здесь мы подробно экспериментальные методы, используемые для оценки силы выступа, которые podosomes применить на совместимый фильм, от подготовки фильма для автоматизированного анализа топографических изображений.
В многочисленных биологических контекстах животных клеток необходимо физически взаимодействовать с окружающей их средой путем разработки механических сил. Среди них тяговой силы были хорошо изученных, но существует нехватка технологий, позволяя измерения силы выступ, оказываемое клетки ортогонально к их основанию. Мы разработали экспериментальной установки для измерения силы выступ, оказываемое адэрентных клеток на их поверхности. Клетки, покрытие на листе совместимый Formvar деформируют этот субстрат и результате топографии сопоставляется с атомно-силовой микроскопии (АСМ) в нанометровом масштабе. Затем значения извлекаются из анализ деформации профиля на основе геометрии выступающем клеточных структур. Таким образом силы, оказываемое отдельных выступающих единиц живой клетки может быть измерена с течением времени. Этот метод даст возможность изучения формирования сил и его регулирования во многих клеточных процессах, связанных с выступа. Здесь мы описываем его применение для измерения выступающем силы, порожденные podosomes, образованного человека макрофагов.
Животных клеток физически взаимодействовать с матрицы и другие клетки, которые составляют их окружающей среды1. Это требуется для их переноса, усваивать органы, приобретать внешней информации или дифференцировать. В таких процессах, ячейка должна генерировать механических сил и, как показывают многочисленные исследования за последние годы, способность ячейки для создания сил и зонд окружающей среды влияет на его биологического поведения, например направляя распространения или дифференциация2,3. В свою очередь измерение сотовой сил является основной помощи изучить правила формирования сил и понять ее последствия в клетки тканей и поведение судьба4,5.
Последние годы стали свидетелями многочисленных методов для измерения силы, которые ячейки может оказать на ее окружающей среде6. Большинство из них играют важную роль в раскрытии что тяговых сил, что клетки оказывают как они тянут на мобильных зондов или деформируемые субстрата. Однако механических сил, участвующих в выступ в внеклеточной окружающую среду страдают от отсутствия методов измерения и являются на сегодняшний день не характерны.
Чтобы преодолеть это ограничение, мы представляем метод измерения силы оказываемого ортогонально к подложке. Он состоит в покрытие живых клеток на листе тонкой упругой, могут деформироваться в ортогональных направлении, что делает его возможным для измерения деформации подложки клеток и вывести силы, участвующие. Субстрат топографии измеряется с наночастицами резолюции с помощью атомно-силовой микроскопии и оценки сил от деформации опирается на знание геометрии выступающем клеточных структур7,8, 9.
Здесь мы описываем установку и его применение для измерения силы, порожденные podosomes, выступающем адгезии структуры, образованные макрофаги их мезенхимальных миграции в трехмерных средах10,11, 12,13,14,,1516,17. Мы считаем, что этот метод будет заранее понимание формирования сил и его регулирования во многих клеточных процессах, связанных с выступа.
Свойства материала
Выбор материала для деформируемых мембраны, в нашем случае Formvar, необходимо выполнить несколько требований. Материал должен быть прозрачным для видимого света и выставку ограниченное auto флуоресценции позволяющие наблюдений в светлые област…
The authors have nothing to disclose.
Авторы благодарны Анна Labernadie, Гийом Шарьер и Патрик Delobelle за их первоначальный вклад в эту работу и Matthieu Санчес и Франсуаза Viala за их помощь с видео съемки и редактирования. Эта работа была поддержана l’Agence Nationale de la исследований (ANR14-CE11-0020-02), la Fondation pour la Recherche сообщала (FRM DEQ2016 0334894), INSERM план рака, рака Тулуза Fondation и человека пограничной науки программы (RGP0035/2016).
200 mesh nickel grids | Electron Microscopy Sciences | G200-Ni | |
Filter paper | Sigma-Aldrich | 1001-055 | |
Microscope slides | Fisher Scientific | 10235612 | |
White stickers 26 x 70 mm | Avery | DP033-100 | |
Film casting device with valve in its outlet | Electron Microscopy Sciences | 71305-01 | |
Razorblades | Electron Microscopy Sciences | 72000 | |
Ethanol | VWR | 1.08543.0250 | |
Acetone | VWR | 20066.321 | |
Formvar 0.5% solution in ethylene dichloride | Electron Microscopy Sciences | 15820 | |
12 mm coverslips | VWR | 631-0666 | |
Inverted microscope | Carl Zeiss | Axiovert 200 | |
Atomic Force Microscope | JPK Instruments | NanoWizard III | |
Temperature-controlled sample holder | JPK Instruments | BioCell | |
Silicon nitride cantilever with a nominal spring constant of 0.01 N/m | Veeco Instruments | MLCT-AUHW | |
PBS | Gibco | 14190-094 | |
Double-sided adhesive tape | APLI AGIPA | 118100 | |
RPMI 1640 | Gibco | 31870-025 | |
FCS | Sigma-Aldrich | F7524 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H0887 | |
35 mm glass-bottom Petri dishes | WPI | FD35-100 |