Hier, detail we de experimentele technieken gebruikt om te evalueren van de uitsteeksel krachten die podosomes van toepassing op een compatibele film, vanaf de voorbereiding van de film naar de geautomatiseerde analyse van topografische beelden.
In talrijke biologische contexten moeten dierlijke cellen fysiek interageren met hun omgeving door de ontwikkeling van mechanische krachten. Onder deze, tractie krachten goed gekarakteriseerd zijn geweest, maar er is een gebrek aan technieken waardoor de meting van uitsteeksel krachten uitgeoefend door cellen orthogonaal op hun ondergrond. We ontwierpen een experimentele opstelling het uitsteeksel krachten uitgeoefend door Adherente cellen aan hun substraat te meten. Cellen verguld op een compatibele Formvar vel vervormen dit substraat en de resulterende topografie wordt toegewezen door atomaire kracht microscopie (AFM) op de nanometerschaal. Geldende waarden worden vervolgens geëxtraheerd uit een analyse van het profiel van de vervorming op basis van de geometrie van de protrusive cellulaire structuren. Vandaar, de door de individuele vooruitstekende eenheden van een levende cel uitgeoefende krachten kunnen worden gemeten na verloop van tijd. Deze techniek kan de studie van strijdkrachtgeneratie en de verordening in de vele cellulaire processen waarbij uitsteeksel. Hier beschrijven we de toepassing de protrusive krachten gegenereerd door podosomes gevormd door menselijke macrofagen te meten.
Dierlijke cellen interactie fysiek met de matrix en de andere cellen die hun omgeving1vormen. Dit is vereist voor hen om te migreren, internaliseren van organen, externe informatie verwerven of differentiëren. In dergelijke processen, de cel mechanische krachten moet genereren en, zoals tal van studies hebben getoond in de afgelopen jaren, de mogelijkheid van een cel te genereren van krachten en sonde zijn omgeving beïnvloedt de biologische werking, leiding bijvoorbeeld proliferatie of differentiatie2,3. Op zijn beurt, is de meting van cellulaire krachten een grote steun te bestuderen van de regulering van de strijdkrachtgeneratie en begrijpen de implicatie in cel gedrag en weefsel lot4,5.
De afgelopen jaren getuige geweest van de ontwikkeling van talrijke technieken voor het meten van de krachten die een cel op de omgeving-6 uitoefenen kan. De meerderheid van deze geweest instrumenteel in het openbaren van dat de tractie dwingt dat cellen uitoefenen als zij trek op mobiele sondes of een vervormbare substraat. Echter de mechanische krachten die betrokken zijn in uitsteeksel in de extracellulaire omgeving lijden onder een gebrek aan meettechnieken en zijn tot nu toe niet goed gekenmerkt.
Om deze beperking ondervangen, presenteren we een methode voor het meten van krachten uitgeoefend orthogonaal op de ondergrond. Het bestaat uit het plating levende cellen op een dunne elastische blad dat in de orthogonale richting vervormen kan, waardoor het mogelijk is om te meten van substraat vervorming door de cellen en het afleiden van de krachten die betrokken zijn. Topografie van het substraat wordt gemeten met de nanoschaal resolutie met behulp van atomaire kracht microscopie en de evaluatie van de troepen uit vervorming is gebaseerd op de kennis van de geometrie van de protrusive cellulaire structuren7,–8, 9.
Hier beschrijven we de opstelling en de toepassing ervan voor het meten van de krachten die worden gegenereerd door podosomes, protrusive hechting structuren gevormd door macrofagen voor hun mesenchymale migratie in driedimensionale omgevingen10,11, 12,13,14,15,16,17. Wij zijn van mening dat deze techniek het begrip van strijdkrachtgeneratie en de verordening in de vele cellulaire processen waarbij uitsteeksel zal vooraf.
Materiaaleigenschappen
De keuze van het materiaal voor het vervormbare membraan, in ons geval Formvar, moet aan een aantal voorwaarden voldoen. Het materiaal moet worden transparant voor zichtbaar licht en fluorescentie vertonen beperkte auto zodat opmerkingen in helder veld en fluorescentie microscopie. De ruwheid van de dunne film moet goed minder dan 10 nm te vermijden topografische effect op cel adhesie en duidelijke observatie van de cel-geïnduceerde uitsteeksels door AF…
The authors have nothing to disclose.
De auteurs zijn Anna Labernadie, Guillaume Charrière en Patrick Delobelle dankbaar voor hun eerste bijdrage aan dit werk en Matthieu Sanchez en Françoise Viala voor hun hulp bij de video filmen en bewerken. Dit werk werd ondersteund door l’Agence Nationale de la Recherche (ANR14-CE11-0020-02), la Fondation pour la Recherche Médicale (FRM DEQ2016 0334894), INSERM Plan kanker, Fondation Toulouse kanker en Human Frontier Science Program (RGP0035/2016).
200 mesh nickel grids | Electron Microscopy Sciences | G200-Ni | |
Filter paper | Sigma-Aldrich | 1001-055 | |
Microscope slides | Fisher Scientific | 10235612 | |
White stickers 26 x 70 mm | Avery | DP033-100 | |
Film casting device with valve in its outlet | Electron Microscopy Sciences | 71305-01 | |
Razorblades | Electron Microscopy Sciences | 72000 | |
Ethanol | VWR | 1.08543.0250 | |
Acetone | VWR | 20066.321 | |
Formvar 0.5% solution in ethylene dichloride | Electron Microscopy Sciences | 15820 | |
12 mm coverslips | VWR | 631-0666 | |
Inverted microscope | Carl Zeiss | Axiovert 200 | |
Atomic Force Microscope | JPK Instruments | NanoWizard III | |
Temperature-controlled sample holder | JPK Instruments | BioCell | |
Silicon nitride cantilever with a nominal spring constant of 0.01 N/m | Veeco Instruments | MLCT-AUHW | |
PBS | Gibco | 14190-094 | |
Double-sided adhesive tape | APLI AGIPA | 118100 | |
RPMI 1640 | Gibco | 31870-025 | |
FCS | Sigma-Aldrich | F7524 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H0887 | |
35 mm glass-bottom Petri dishes | WPI | FD35-100 |