בליטה מיקרוסקופ כוח: שיטה לכמת כוחות שפותחה על ידי בליטות תא
Summary
כאן, אנחנו מפרטים את הטכניקות ניסיוני המשמשים להערכת כוחות בליטה podosomes להחיל על סרט תואם, משלב הכנת הסרט לניתוח אוטומטי של תמונות הטופוגרפי.
Abstract
בהקשרים ביולוגיים רבים, תאים בעלי חיים צריך אינטראקציה פיזית עם הסביבה שלהם על ידי פיתוח כוחות מכני. בין אלה, כוחות המתיחה היה מאופיין היטב, אך יש חוסר של טכניקות המאפשר מדידת כוחות בליטה שהופעל על ידי תאים orthogonally המצע שלהם. תיכננו התקנה ניסיוני. למדידת כוחות בליטה שהופעל על ידי תאים חסיד על המצע שלהם. תאי ציפוי על גליון Formvar תואם לעוות את המצע, הטופוגרפיה וכתוצאה מכך ממופה על ידי מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) את המשקל ננומטר. כוח ערכים המחולצים ואז ניתוח של הפרופיל דפורמציה בהתבסס על הגיאומטריה של המבנים התאיים protrusive. לפיכך, ניתן למדוד את הכוחות שהופעל על ידי היחידות בולט בודדים של תא חי לאורך זמן. טכניקה זו תאפשר המחקר של יצירת כח ורגולציה שלה בתהליכי הסלולר רבים המערבים בליטה. כאן, אנו מתארים את היישום שלה כדי למדוד את הכוחות protrusive שנוצר על ידי podosomes הנוצרת על-ידי מקרופאגים אנושי.
Introduction
תאים בעלי חיים אינטראקציה פיזית עם המטריקס, התאים האחרים המהווים את הסביבה שלהם1. פעולה זו נדרשת כדי להעביר, להפנים גופות, לרכוש מידע חיצוני או להבדיל. בתהליכי כזה, התא צריך להקרין כוחות מכני ומשפיע, כמו מחקרים רבים הראו בשנים האחרונות, היכולת של תא כדי ליצור כוחות, לחקור את הסביבה שלה התנהגות ביולוגית, בימוי למשל התפשטות או בידול2,3. בתורו, המדידה של כוחות הסלולר היא מכשיר מרכזי לימוד ויסות כוח הדור ולהבין את המשמעות שלה תא התנהגות ורקמות גורל4,5.
בשנים האחרונות עדים על התפתחות טכניקות רבות כדי למדוד את הכוחות תא יכול להפעיל על הסביבה שלה6. רוב אלה סייעו חושפים שהמתיחה כוחות כי תאים להפעיל כפי שהם מושכים על הגששים ניידים או מצע deformable. עם זאת, הכוחות מכניים מעורבים בליטה לסביבת חוץ-תאית סובלים מחסור של טכניקות מדידה והם עד היום לא טוב מאופיין.
כדי להתגבר על מגבלה זו, אנו מציגים שיטה למדידת כוחות המופעל orthogonally אל המצע. זה מורכב ב ציפוי חיים תאים בגיליון אלסטי דק אשר ניתן לעוות בכיוון אורתוגונלית, דבר המאפשר למדוד דפורמציה המצע על ידי התאים ולהסיק את הכוחות המעורבים. המצע הטופוגרפיה נמדד עם רזולוציה הננומטרי באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי, הערכת כוחות של דפורמציה מסתמך על הידע של הגיאומטריה של מבנים הסלולר protrusive7,8, 9.
כאן, אנו מתארים את הכיוונון ויישומה למדידת הכוחות שנוצר על ידי podosomes, מבנים אדהזיה protrusive הנוצרת על-ידי מקרופאגים להעברת mesenchymal שלהם סביבות תלת-ממדי10,11, 12,13,14,15,16,17. אנו מאמינים כי טכניקה זו תקדם את ההבנה של יצירת כח ורגולציה שלה בתהליכי הסלולר רבים המערבים בליטה.
Protocol
Representative Results
Discussion
תכונות החומר
הבחירה של החומר עבור ממברנה deformable, במקרה שלנו Formvar, צריך למלא כמה דרישות. החומר חייב להיות שקוף האור הנראה ולהציג קרינה פלואורסצנטית אוטומטי מוגבלת כדי לאפשר תצפיות בשדה בהירים ואת פלורסצנטיות מיקרוסקופ. המראה המחוספס של הסרט דק חייב להיות מתחת 10 ננומ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים אנה Labernadie, גיום Charrière, פטריק Delobelle על תרומתה הראשונית לעבודה זו, מתיו סנצ’ז, פרנסואז Viala על עזרתם עם צילום וידאו ועריכה. עבודה זו היא נתמכה על ידי l’Agence נאסיונאל דה לה Recherche (ANR14-CE11-0020-02), la Fondation pour la Médicale רשרש (עקרות DEQ2016 0334894), INSERM תוכנית סרטן, סרטן Fondation טולוז, הגבול האנושי המדע תוכנית (RGP0035/2016).
Materials
| 200 mesh nickel grids | Electron Microscopy Sciences | G200-Ni | |
| Filter paper | Sigma-Aldrich | 1001-055 | |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 10235612 | |
| White stickers 26 x 70 mm | Avery | DP033-100 | |
| Film casting device with valve in its outlet | Electron Microscopy Sciences | 71305-01 | |
| Razorblades | Electron Microscopy Sciences | 72000 | |
| Ethanol | VWR | 1.08543.0250 | |
| Acetone | VWR | 20066.321 | |
| Formvar 0.5% solution in ethylene dichloride | Electron Microscopy Sciences | 15820 | |
| 12 mm coverslips | VWR | 631-0666 | |
| Inverted microscope | Carl Zeiss | Axiovert 200 | |
| Atomic Force Microscope | JPK Instruments | NanoWizard III | |
| Temperature-controlled sample holder | JPK Instruments | BioCell | |
| Silicon nitride cantilever with a nominal spring constant of 0.01 N/m | Veeco Instruments | MLCT-AUHW | |
| PBS | Gibco | 14190-094 | |
| Double-sided adhesive tape | APLI AGIPA | 118100 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 31870-025 | |
| FCS | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H0887 | |
| 35 mm glass-bottom Petri dishes | WPI | FD35-100 |
References
- Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. L. Tissue Cells Feel and Respond to the Stiffness of Their Substrate. Science. 310, 1139-1143 (2005).
- Paszek, M. J., et al. Tensional Homeostasis and the Malignant Phenotype. Cancer Cell. 8, 241-254 (2005).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix Elasticity Directs Stem Cell Lineage Specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
- Gilbert, P. M., Weaver, V. M. Cellular Adaptation to Biomechanical Stress across Length Scales in Tissue Homeostasis and Disease. Seminars in Cell & Developmental Biology. 67, 141-152 (2017).
- Vining, K. H., Mooney, D. J. Mechanical Forces Direct Stem Cell Behaviour in Development and Regeneration. Nature Reviews Molecular Cell Biology. , (2017).
- Roca-Cusachs, P., Conte, V., Trepat, X. Quantifying Forces in Cell Biology. Nature Cell Biology. 19, 742-751 (2017).
- Labernadie, A., et al. Protrusion Force Microscopy Reveals Oscillatory Force Generation and Mechanosensing Activity of Human Macrophage Podosomes. Nature Communications. 5, 5343 (2014).
- Proag, A., et al. Working Together: Spatial Synchrony in the Force and Actin Dynamics of Podosome First Neighbors. ACS Nano. 9, 3800-3813 (2015).
- Proag, A., Bouissou, A., Vieu, C., Maridonneau-Parini, I., Poincloux, R. Evaluation of the Force and Spatial Dynamics of Macrophage Podosomes by Multi-Particle Tracking. Methods. 94, 75-84 (2016).
- Cougoule, C., et al. Three-Dimensional Migration of Macrophages Requires Hck for Podosome Organization and Extracellular Matrix Proteolysis. Blood. 115, 1444-1452 (2010).
- Cougoule, C., et al. Blood Leukocytes and Macrophages of Various Phenotypes Have Distinct Abilities to Form Podosomes and to Migrate in 3d Environments. European Journal of Cell Biology. 91, 938-949 (2012).
- Guiet, R., et al. Macrophage Mesenchymal Migration Requires Podosome Stabilization by Filamin A. Journal of Biological Chemistry. 287, 13051-13062 (2012).
- Maridonneau-Parini, I. Control of Macrophage 3d Migration: A Therapeutic Challenge to Limit Tissue Infiltration. Immunology Review. 262, 216-231 (2014).
- Park, H., et al. Tyrosine Phosphorylation of Wiskott-Aldrich Syndrome Protein (Wasp) by Hck Regulates Macrophage Function. Journal of Biological Chemistry. 289, 7897-7906 (2014).
- Van Goethem, E., et al. Macrophage Podosomes Go 3d. European Journal of Cell Biology. 90, 224-236 (2011).
- Van Goethem, E., Poincloux, R., Gauffre, F., Maridonneau-Parini, I., Le Cabec, V. Matrix Architecture Dictates Three-Dimensional Migration Modes of Human Macrophages: Differential Involvement of Proteases and Podosome-Like Structures. Journal of Immunology. 184, 1049-1061 (2010).
- Verollet, C., et al. Hiv-1 Reprograms the Migration of Macrophages. Blood. 125, 1611-1622 (2015).
- Bouissou, A., et al. Podosome Force Generation Machinery: A Local Balance between Protrusion at the Core and Traction at the Ring. ACS Nano. 11, 4028-4040 (2017).
- Lizarraga, F., et al. Diaphanous-Related Formins Are Required for Invadopodia Formation and Invasion of Breast Tumor Cells. Cancer Research. 69, 2792-2800 (2009).
- Carman, C. V., et al. Transcellular Diapedesis Is Initiated by Invasive Podosomes. Immunity. 26, 784-797 (2007).
- Sage, P. T., et al. Antigen Recognition Is Facilitated by Invadosome-Like Protrusions Formed by Memory/Effector T Cells. Journal of Immunology. 188, 3686-3699 (2012).
- Sens, K. L., et al. An Invasive Podosome-Like Structure Promotes Fusion Pore Formation During Myoblast Fusion. Journal of Cell Biology. 191, 1013-1027 (2010).
- Takito, J., et al. The Transient Appearance of Zipper-Like Actin Superstructures During the Fusion of Osteoclasts. Journal of Cell Science. 125, 662-672 (2012).
- Shilagardi, K., et al. Actin-Propelled Invasive Membrane Protrusions Promote Fusogenic Protein Engagement During Cell-Cell Fusion. Science. 340, 359-363 (2013).
- Freeman, S. A., et al. Integrins Form an Expanding Diffusional Barrier That Coordinates Phagocytosis. Cell. 164, 128-140 (2016).
