Murine Speichel funktionale Bewertung über Pilocarpin Stimulation folgenden fraktioniert Bestrahlung
Summary
Wir präsentieren Ihnen einen detaillierten Ansatz zur Durchführung von Speichel Sammlung, einschließlich murinen Tracheostoma und die Isolation der drei großen Speicheldrüsen.
Abstract
Hyposalivation wird allgemein in der Autoimmun-Reaktion von Sjögren Syndrom oder die folgenden Strahlung Verletzung der großen Speicheldrüsen beobachtet. In diesen Fällen bleiben Fragen hinsichtlich der Pathogenese der Krankheit und wirksame Interventionen. Eine optimierte Technik, die funktionale Bewertung der Speicheldrüsen können, ist von unschätzbarem Wert für die Untersuchung von therapeutisches Drüse Biologie, Dysfunktion und Therapeutika. Hier präsentieren wir einen Schritt-für-Schritt-Ansatz zur Durchführung von Pilocarpin stimuliert die Sekretion von Speichel, einschließlich Tracheostoma und die Zerlegung der drei großen murinen Speicheldrüsen. Wir ausführlich auch die entsprechenden murine Kopf und Hals Anatomie während dieser Techniken zugegriffen. Dieser Ansatz ist skalierbar, so dass für mehrere Mäuse gleichzeitig verarbeitet werden somit die Effizienz der Arbeitsabläufe. Unser Ziel ist es, die Reproduzierbarkeit dieser Methoden zu verbessern, von die jede weitere Anwendungen auf dem Gebiet hat. Neben Speichel Sammlung diskutieren wir Metriken für die Quantifizierung und Normalisierung der Funktionsfähigkeit dieser Gewebe. Repräsentative Daten sind 2 Wochen nach der fraktionierte Bestrahlung (4 Dosen von 6,85 Gy) von mandibulären Drüsen mit depressiven Speicheldrüse Funktion enthalten.
Introduction
Speicheldrüse Störungen gehören Syndrome Dysregulated oder beeinträchtigt Sekretion führt zu Überproduktion (Sialorrhea) oder Unterproduktion (Xerostomie und endodontischen) Speichel1. In beiden Fällen gibt es Interesse an der Verbesserung unser Verständnis der Biologie der Speicheldrüse auf das Endziel der therapeutischen Entwicklung2.
Die Speicheldrüsen sind sehr strahlenempfindlichen Organe und sind oft im Kopf und Nacken Krebs Strahlentherapie, führt zu dauerhaften Mundtrockenheit (Xerostomie)3,4beschädigt. Im Gegensatz zu anderen strahlenempfindlichen Geweben Speicheldrüse Fluktuationsrate ist relativ gering, und der Mechanismus der sekretorischen Verlust ist schlecht verstandene5,6. In dieser Umgebung einzigartig Verletzung erfordern Gewebe-Regeneration und Strahlenschutz-Strategien Speichel funktionale Bewertung. Experimentell, ist murine Speichel Sammlung ein besonders wertvolles Instrument bei der Bewertung der Drüse auf Strahlung und Therapeutika.
Hier präsentieren wir Ihnen eine Methode für die Durchführung und Quantifizierung der stimulierten Speichels Sekretion mit Pilocarpin, eine potente muskarin Agonist-7. Pilocarpin stimuliert das vegetative Nervensystem Drüse Sekret8,9induzieren. Um diesen Test entsprechend abzuschließen, ist ein Tracheostoma erforderlich, um sicherzustellen, dass die Maus hält ein patent Atemwege während des Verfahrens und zur Reduzierung des Risikos von Würgen und Aspiration von gepoolten Sekret in der Mundhöhle10.
Dies ist ein terminal Verfahren, die ihren Höhepunkt bei der Entfernung von den drei großen Speicheldrüsen: die Parotis (PG), der mandibulären (SMG) und der Sublingual (SLG). Für funktionelle Studien Drüse Gewichte werden aufgezeichnet und werden oft verwendet, um Speichel Messung11,12,13zu normalisieren. Diese Daten sind besonders wichtig in Strahlung Studien, wobei Drüse Atrophie ein erwartetes Ergebnis14,15 ist
Gibt es Variabilität in der Literatur in Bezug auf wie stimuliert Sekretion von Speichel erfolgt und16berichtet. Z. B. Pilocarpin Dosen innerhalb der Literatur Span mindestens drei Größenordnungen17,18,19,20,21,22,23. Hier präsentieren wir Ihnen eine optimierte hochdosierte Pilocarpin-Protokoll mit der Absicht der verbesserte Reproduzierbarkeit Methodenausführung sowie eine modulare Plattform von Techniken (Tracheostoma, Speichel Sammlung und Drüse Dissektion), die als angepasst werden kann benötigt.
Wir gehören neben Protokoll Demo 2 Wochen nach fraktionierte Bestrahlung (4 Dosen von 6,85 Gy) für die SMG-Region repräsentative Funktionsdaten des Speichelflusses.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wir präsentieren Ihnen eine mehrstufige Methode zur Speicheldrüse Funktion bewerten die Drüse Verletzungen und Therapeutika studieren angewendet werden können. Unsere Verfahren beinhaltet Tracheostoma, Speichel Sammlung und Drüse Dissektion, von denen jede experimentelle Anwendungen hat, die ein integriertes Studium der Speicheldrüse Biologie unterstützen kann. Beispielsweise hat murinen Tracheostoma für allgemeine Atemwegsmanagement bei Eingriffen, die Behinderung der Mundhöhle verwendet worden.
<p class="j…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forschung berichtet in dieser Publikation wurde durch das nationale Institut des Dental und Craniofacial Forschung (NIDCR) und das National Cancer Institute (NCI) der National Institutes of Health Award Anzahl R56 DE025098, UG3 DE027695 und F30 CA206296 unterstützt. Der Inhalt ist ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und nicht unbedingt die offizielle Meinung der National Institutes of Health. Diese Arbeit wurde auch von der NSF-DMR-1206219 und der IADR-Innovation in Oral Care Award (2016) unterstützt.
Wir möchten Dr. Eri Maruyama und Andrew Hollomon danken für ihre Unterstützung mit Speichel-Kollektion. Wir möchten Pei-Lun Weng danken für Unterstützung mit Drüse Dissektion. Wir möchten danken Matthew Ingalls für seine Unterstützung bei der Vorbereitung der Figur. Wir möchten Dr. Elaine Smolock und Emily Wu für kritische Lektüre des Manuskripts danken.
Materials
| Pilocarpine hydrochloride | Sigma Aldrich | P6503 | Pilocarpine |
| Student Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 91500-9 | Spring Scissors for Tracheostomy |
| Sterile Saline Solution | Medline | RDI30296H | Saline |
| Dumont #7 Forceps | Fine Science Tools | 11274-20 | Curved Forceps |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | Straight Forceps |
| Standard Pattern Forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | Blunt Forceps |
| Fine Scissors- Tungsten Carbide | Fine Science Tools | 14568-09 | Dissection Scissors |
| Microhematocrit Heparinized Capillary Tubes | Fisher Scientific | 22362566 | Capillary tubes |
| Lubricant Eye Ointment | Refresh | N/A | Refresh Lacri-Lube |
| Goat polyclonal anti-Nkcc1 | Santa Cruz Biotech | SC-21545 | Nkcc1 Antibody |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | DAPI |
| GraphPad Prism | GraphPad | ver6.0 | Statistical Software |
| Cotton tipped applicator | Medline | MDS202000 | Applicator for eye ointment |
| 0.5cc Insulin Syringe, 29G x 1/2" | BD | 7629 | Syringe for intraperitoneal injection |
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