Nous présentons une approche détaillée pour effectuer le prélèvement de salive, y compris la trachéotomie murin et l’isolement des trois glandes salivaires principales.
Hypoptyalisme est fréquemment observé dans la réaction auto-immune du syndrome de Sjögren ou d’après une blessure rayonnement vers les glandes salivaires principales. Dans ces cas, les questions demeurent au sujet de la pathogenèse de la maladie et des interventions efficaces. Une technique optimisée qui permet l’évaluation fonctionnelle des glandes salivaires est inestimable pour l’étude thérapeutique, dysfonction et la biologie des glandes exocrines. Ici, nous présentons une approche étape par étape, lorsque vous exécutez pilocarpine stimule la sécrétion de salive, y compris la trachéotomie et la dissection des trois principales glandes salivaires murines. Nous détaillons également l’anatomie tête et cou murine approprié consultée au cours de ces techniques. Cette approche est évolutive, permettant plusieurs souris être traitées simultanément, améliorant ainsi l’efficacité du flux de travail. Notre objectif est d’améliorer la reproductibilité de ces méthodes, dont chacun contient d’autres applications dans le domaine. En plus de prélèvement de salive, nous discutons des métriques pour quantifier et normaliser la capacité fonctionnelle de ces tissus. Des données représentatives sont incluses à partir des glandes sous-maxillaires avec la fonction des glandes salivaires déprimé 2 semaines après l’irradiation fractionnée (4 doses de 6,85 Gy).
Troubles des glandes salivaires incluent syndrome de dysrégulation ou ayant une déficience de sécrétion conduisant à la surproduction (sialorrhée) ou sous-production (xérostomie et hypoptyalisme) de salive1. Dans les deux cas, il y a un intérêt dans l’amélioration de notre compréhension de la biologie de la glande salivaire vers le but ultime de développement thérapeutique2.
Les glandes salivaires sont des organes très radiosensibles et sont souvent endommagés au cours de la radiothérapie du cancer tête et cou, conduisant à une sécheresse permanente de la bouche (xérostomie)3,4. Contrairement aux autres tissus radiosensibles, cependant, les taux de roulement des glandes salivaires est relativement faible, et le mécanisme de perte sécrétoire est mal compris5,6. Dans ce cadre unique blessure, stratégies de régénération et de la radioprotection tissu exigent une évaluation fonctionnelle salivaire. Expérimentalement, prélèvement de salive murin est un outil particulièrement précieux pour évaluer la réaction de glande à rayonnement et agents thérapeutiques.
Nous présentons ici une méthode pour effectuer et quantifier la sécrétion de salive stimulée à l’aide de la pilocarpine, un puissant agoniste muscarinique7. Pilocarpine stimule le système nerveux pour induire la sécrétion de la glande8,9. Pour compléter ce test convenablement, une trachéotomie est nécessaire pour s’assurer que la souris conserve un brevet airway tout au long de la procédure et de réduire les risques d’étouffement et d’aspiration des sécrétions regroupées dans la cavité buccale10.
Il s’agit d’une procédure de terminale, qui a abouti à la suppression des trois glandes salivaires principales : la glande parotide (PG), la sous-maxillaire (SMG) et la sublinguale (SLG). Pour des études fonctionnelles, poids de la glande sont enregistrées et sont souvent utilisés pour normaliser la salive mesure11,12,13. Ces données sont particulièrement importantes dans les études de rayonnement, dans laquelle une atrophie de la glande est un résultat attendu14,15
Il y a la variabilité dans la littérature en ce qui concerne la sécrétion de salive comment stimulée est effectuée et rapporté16. Par exemple, les doses de pilocarpine dans la littérature portée au moins trois ordres de grandeur17,18,19,20,21,22,23. Nous présentons ici un protocole de pilocarpine optimisée de dose élevée avec l’intention de reproductibilité améliorée dans l’exécution de la méthode, comme fournissant une plate-forme modulaire de techniques (trachéotomie, prélèvement de salive et dissection de la glande) qui peut être adapté comme nécessaires.
En plus de la démonstration de protocole, nous incluons des données fonctionnelles représentatives des flux de salive à 2 semaines après l’irradiation fractionnée (4 doses de 6,85 Gy) dans la région SMG.
Nous présentons une méthode plusieurs étapes pour évaluer la fonction des glandes salivaires, qui peut être appliquée à l’étude thérapeutique et lésion de la glande. Notre procédé implique la trachéotomie, prélèvement de salive et dissection de la glande, dont chacun a des applications expérimentales qui peuvent soutenir une étude intégrée de la biologie de la glande salivaire. Par exemple, trachéotomie murine a servi pour la gestion des voies aériennes générales au cours de procédures obstruant…
The authors have nothing to disclose.
Recherche rapporté dans cette publication a été financée par le National Institute of Dental et recherche Craniofacial (NIDCR) et le National Cancer Institute (NCI) de la National Institutes of Health, sous attribution numéro R56 DE025098 et UG3 DE027695 F30 CA206296. Le contenu est la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement l’opinion officielle de la National Institutes of Health. Ce travail a été également soutenu par la NSF DMR 1206219 et de l’Innovation de l’AIRD en Oral Care Award (2016).
Nous tenons à remercier le Dr Eri Maruyama et Andrew Hollomon pour leur aide avec prélèvement de salive. Nous tenons à remercier Weng Pei-Lun pour son aide avec dissection de la glande. Nous tenons à remercier Matthew Ingalls pour son aide dans la préparation de la figure. Nous tenons à remercier le Dr Elaine Smolock et Emily Wu pour une lecture critique de ce manuscrit.
Pilocarpine hydrochloride | Sigma Aldrich | P6503 | Pilocarpine |
Student Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 91500-9 | Spring Scissors for Tracheostomy |
Sterile Saline Solution | Medline | RDI30296H | Saline |
Dumont #7 Forceps | Fine Science Tools | 11274-20 | Curved Forceps |
Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | Straight Forceps |
Standard Pattern Forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | Blunt Forceps |
Fine Scissors- Tungsten Carbide | Fine Science Tools | 14568-09 | Dissection Scissors |
Microhematocrit Heparinized Capillary Tubes | Fisher Scientific | 22362566 | Capillary tubes |
Lubricant Eye Ointment | Refresh | N/A | Refresh Lacri-Lube |
Goat polyclonal anti-Nkcc1 | Santa Cruz Biotech | SC-21545 | Nkcc1 Antibody |
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | DAPI |
GraphPad Prism | GraphPad | ver6.0 | Statistical Software |
Cotton tipped applicator | Medline | MDS202000 | Applicator for eye ointment |
0.5cc Insulin Syringe, 29G x 1/2" | BD | 7629 | Syringe for intraperitoneal injection |