Summary

Изоляция и характеристика внеклеточного везикулы от взрослых Schistosoma японский

Published: May 22, 2018
doi:

Summary

Здесь мы представляем протокол для описания изоляции внеклеточного везикулы (EVs) в в vitro культурной среде от взрослых Schistosoma японский.

Abstract

Внеклеточные везикулы (EVs) являются мембранные везикулы, выпущенная различных клеток в внеклеточной микроокружения. EVs представляют население гетерогенных везикулы, чей размер диапазона от 40 до 1000 Нм. Накопленных доказательств указал, что EVs играют важную роль регулирования в возбудитель хост взаимодействий. Глубокое понимание schistosome EVs должны обеспечить понимание механизмов лежащие в основе взаимодействия schistosome хост, позволяя развития новых стратегий по борьбе с шистосомозом. Здесь мы стремимся дальнейшего изучения функций EVs в шистосомоз, представив протокол для изоляции и характеристика EVs от взрослых Schistosoma японский (S. Японский). EVs были изолированы от в vitro питательной среды с помощью центрифугирования, в сочетании с комплектом изоляции коммерческих exosome. Изолированные S. Японский EVs (SjEVs) обычно обладают диаметром 100-400 Нм и характеризуются просвечивающей электронной микроскопии и Западный blotting. Использование PKH67 краска меченых SjEVs продемонстрировал, что SjEVs относить на счет получателя клетки. В целом наш протокол предоставляет альтернативный метод для изоляции EVs от взрослых шистосомоз; изолированные SjEVs могут быть пригодны для функционального анализа.

Introduction

Внеклеточные везикулы (EVs) являются население малых мембраны прыгните везикулы, инкапсулированный с различными белки, липиды и нуклеиновых кислот. Недавние исследования показали, что EVs играют решающую роль в ячейке коммуникации и участвуют в регуляции многих физиологических процессов, включая развитие клеток, иммунных регулирование, ангиогенез и клеток миграции2, 3,4,5. Накопление доказательств показывает, что EVs, циркулирующих exosomes, а их груз, Мирна представляет потенциальные biomarkers некоторых заболеваний6.

Несколько простейших как Trichomonas vaginalis, Trypanosoma cruziи лейшмании spp., показали, чтобы иметь возможность выделять EVs; Дополнительно были обнаружены глисты выделяют EVs в жизни хостов7. Было показано, что паразитарные EVs участвовать в поддержании инфекции, патогенности8и иммунных правила9. Последние исследования в шистосомоз 10,оба Schistosoma mansoni (S. mansoni)11 и12 S. Японскийуказали, что взрослый шистосомоз выделяют exosome как пузырьки, которые могут быть участие в функциональных положений конкретных биологических процессов.

На сегодняшний день, были использованы несколько методов изолировать внеклеточного везикулы, таких как ultracentrifugation, ультрафильтрация13, использование реагентов на полимерной основе, размер-гель-проникающей хроматографии и immunoaffinity изоляции. Эти различные методы имеют свои собственные преимущества и ограничения14. Как правило ultracentrifugation считается золотым стандартом метод для изоляции везикул. Однако этот метод страдает от ограничения потенциальных EV агрегации14.

Шистосомоз, пару методов были зарегистрированы для изоляции EV: к ним относятся ultracentrifugation11,12,10 и использование коммерческих EV изоляции комплект16 в несколько этапов (16яйца, schistosomula11, Взрослый шистосомоз10,12,17). Учитывая, что микровезикулы имеют широкий спектр размером от нескольких сотен нанометров до тысяч нанометров, мы разработали альтернативный метод, который сочетает в себе использование скамейке центрифуги, ультрафильтрации и коммерческих EV изоляции комплект изолировать EVs от Взрослый Schistosoma японский. Изолированные EVs обычно обладают диаметром 100-400 Нм и были успешно внедрено клетками получателя.

Protocol

Все эксперименты на животных были утверждены местным Этический Комитет Шанхай ветеринарных научно-исследовательского института, Китайская академия сельскохозяйственных наук (разрешение на номер: SHVRIAU-14-0101). 1. в Vitro культуры шистосомоз Примеч…

Representative Results

Для количественной оценки урожайности изолированных SjEVs с использованием описанных протокола, мы использовали BCA assay протеина для доступа к концентрации белков изолированных SjEVs от 28-дневный взрослых шистосомоз. Как показано в таблице 1, концентрация белка SjEV…

Discussion

Недавние исследования по EVs показали, что schistosome, которую EVs играют важную роль в хост возбудитель взаимодействия3,9,12,16. Для дальнейшего решения своих нормативных функций, важно изолировать EVs от шистосомоз. Здесь мы оп…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Это исследование было, в части или в целом, поддержке национальных естественных наук фонд Китая (31472187 и 31672550) и сельскохозяйственной науки и технологии инновации программа Китайской академии сельскохозяйственных наук.

Materials

Material
Total Exosome Isolation Reagent (from cell culture media) ThermoFisher SCIENTIFIC 4478359 For isolating S. japonicum extracellular vesicles
PKH67 Sigma-aldrich MINI67 For labeling Evs
RPMI 1640 Medium ThermoFisher SCIENTIFIC 11875119 For parasite culture
Penicillin-Streptomycin ThermoFisher SCIENTIFIC 15140122
0.22μm syringe filter Merck SLGP033RB
SnakeSkin Dialysis Tubing Thermo SCIENTIFIC 68035
PEG8000 Sangon Biotech A100159 
RIPA Beyotime P0013B
EMD Millipore™ Immobilon™ Western Chemiluminescent HRP Substrate (ECL) Fisher scientific WBKLS0100 
DAPI Cell Signaling Technology 4083
BCA kit Beyotime P0010
CD63 antibodies Sangon Biotech D160973-0025
PVDF Bio-Rad 1704273
Formvar/Carbon 400 mesh Ted Pella 01754-F
Phosphotungstic Acid Ted Pella 19402
anti-mouse IgG-HRP CWBIO CW0102
NCTC clone 1469 cells ATCC ATCC® CCL-9.1™
FBS HyClone SV30087.02
Equipments
GE chemoluminescance imaging system GE ImageQuant LAS4000mini
Transmission electron microscopy Hitachi H-7600
Milli-Q water Milli-Q Milli-Q Elix
Eppendor Centrifuge  Eppendorf Centrifuge 5804R
Zetasizer Nano Malvern Zetasizer Nano ZS 
Ultracentrifuge Beckman Optima L-100 XP Ultracentrifuge
Incubator ESCO CCL-107B
Microscope Zeiss Zeiss Axin Observer Z1

References

  1. Tetta, C., Ghigo, E., Silengo, L., Deregibus, M. C., Camussi, G. Extracellular vesicles as an emerging mechanism of cell-to-cell communication. Endocrine. 44 (1), 11-19 (2013).
  2. Abels, E. R., Breakefield, X. O. Introduction to Extracellular Vesicles: Biogenesis, RNA Cargo Selection, Content, Release, and Uptake. Cell Mol Neurobiol. 36 (3), 301-312 (2016).
  3. Riaz, F., Cheng, G. Exosome-like vesicles of helminths: implication of pathogenesis and vaccine development. Ann Transl Med. 5 (7), 175 (2017).
  4. Zhang, H. G., Grizzle, W. E. Exosomes and cancer: a newly described pathway of immune suppression. Clin Cancer Res. 17 (5), 959-964 (2011).
  5. Colombo, M., Raposo, G., Thery, C. Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles. Annu Rev Cell Dev Biol. 30, 255-289 (2014).
  6. Li, Y., et al. Circular RNA is enriched and stable in exosomes: a promising biomarker for cancer diagnosis. Cell Res. 25 (8), 981-984 (2015).
  7. Marcilla, A., et al. Extracellular vesicles in parasitic diseases. J Extracell Vesicles. 3, 25040 (2014).
  8. Cwiklinski, K., et al. The Extracellular Vesicles of the Helminth Pathogen, Fasciola hepatica: Biogenesis Pathways and Cargo Molecules Involved in Parasite Pathogenesis. Mol Cell Proteomics. 14 (12), 3258-3273 (2015).
  9. Buck, A. H., et al. Exosomes secreted by nematode parasites transfer small RNAs to mammalian cells and modulate innate immunity. Nat Commun. 5, 5488 (2014).
  10. Sotillo, J., et al. Extracellular vesicles secreted by Schistosoma mansoni contain protein vaccine candidates. Int J Parasitol. 46 (1), 1-5 (2016).
  11. Nowacki, F. C., et al. Protein and small non-coding RNA-enriched extracellular vesicles are released by the pathogenic blood fluke Schistosoma mansoni. J Extracell Vesicles. 4, 28665 (2015).
  12. Wang, L., et al. Exosome-like vesicles derived by Schistosoma japonicum adult worms mediates M1 type immune- activity of macrophage. Parasitol Res. 114 (5), 1865-1873 (2015).
  13. Koh, Y. Q., Almughlliq, F. B., Vaswani, K., Peiris, H. N., Mitchell, M. D. Exosome enrichment by ultracentrifugation and size exclusion chromatography. Front Biosci (Landmark Ed). 23, 865-874 (2018).
  14. Safdar, A., Saleem, A., Tarnopolsky, M. A. The potential of endurance exercise-derived exosomes to treat metabolic diseases. Nat Rev Endocrinol. 12 (9), 504-517 (2016).
  15. Livshits, M. A., et al. Isolation of exosomes by differential centrifugation: Theoretical analysis of a commonly used protocol. Sci Rep. 5, 17319 (2015).
  16. Zhu, S., et al. Release of extracellular vesicles containing small RNAs from the eggs of Schistosoma japonicum. Parasit Vectors. 9 (1), 574 (2016).
  17. Zhu, L., et al. Molecular characterization of S. japonicum exosome-like vesicles reveals their regulatory roles in parasite-host interactions. Sci Rep. 6, 25885 (2016).
  18. Lewis, F. Schistosomiasis. Curr Protoc Immunol. , 11 (2001).
  19. Cheng, G. Circulating miRNAs: roles in cancer diagnosis, prognosis and therapy. Adv Drug Deliv Rev. 81, 75-93 (2015).

Play Video

Cite This Article
Liu, J., Zhu, L., Wang, L., Chen, Y., Giri, B. R., Li, J., Cheng, G. Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles from Adult Schistosoma japonicum. J. Vis. Exp. (135), e57514, doi:10.3791/57514 (2018).

View Video