Summary

בידוד ושלפוחיות אפיון של חוץ-תאית מן הבוגרים עלקת הבילהרציה japonicum

Published: May 22, 2018
doi:

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לתיאור חוץ-תאית שלפוחית (EVs) בידוד במבחנה בינוני בתרבית מ למבוגרים עלקת הבילהרציה japonicum.

Abstract

חוץ-תאית שלפוחית (EVs) הם עלי הלוואי קרומיים שלפוחית שפורסמו על ידי מגוון רחב של תאים לתוך microenvironment חוץ-תאית. EVs לייצג אוכלוסייה של שלפוחית הטרוגנית, אשר גודל נע בין 40 ו- 1,000 ננומטר. ראיות המצטבר ציינו כי EVs תפקיד חשוב רגולטוריות פתוגן-פונדקאי אינטראקציות. הבנה עמוקה של schistosome EVs צריך לספק תובנות לגבי המנגנונים אינטראקציות schistosome-מארח, המאפשר פיתוח של אסטרטגיות הרומן נגד בילהרציה. כאן, אנו שואפים המשך מחקר EVs פונקציות ב- schistosomes על-ידי הצגת פרוטוקול להצפנה בידוד ואפיון של EVs מן הבוגרים עלקת הבילהרציה japonicum (S. japonicum). EVs הם בודדו אותנו מהמתרחש in vitro לקשרי תרבות בינוני באמצעות צנטריפוגה בשילוב עם ערכת בידוד exosome מסחרי. מבודדים japonicum ס EVs (SjEVs) בדרך כלל בעלי קוטר של 100-400 ננומטר, מאופיינים על ידי שידור מיקרוסקופיה אלקטרונית החיוורים ומכתים המערבי. השימוש PKH67 צבע התווית על-ידי SjEVs הוכיחה כי SjEVs הם לנחלתו של התאים הנמען. בסך הכל, פרוטוקול שלנו מספק שיטה חלופית עבור בידוד EVs מ schistosomes למבוגרים; SjEVs מבודדים עשוי להיות מתאים אנליזה פונקציונלית.

Introduction

חוץ-תאית שלפוחית (EVs) הם אוכלוסיה של קטן מאוגד-קרום שלפוחית אנקפסולציה עם חלבונים, ליפידים ו חומצות גרעין שונות. מחקרים שנעשו לאחרונה הראו כי EVs לשחק תפקיד מכריע תקשורת, מעורבים בוויסות תהליכים פיזיולוגיים רבים, לרבות פיתוח תא, ויסות מערכת החיסון, אנגיוגנזה תא העברה2, 3,4,5. לצבירת ראיות מציין כי EVs, במחזור exosomes, ואת המטען שלהם miRNA מייצג פוטנציאל סמנים ביולוגיים של מחלות מסוימות6.

מספר חד-תאיים כגון Trichomonas vaginalis, Trypanosoma cruzi, לישמניה spp-, הוכחו להיות מסוגל להפריש EVs; helminths בנוסף נמצאו להפריש EVs לתוך החיים המארח7. EVs טפיליות הוכחו להיות מעורב קיומו של זיהום, פתוגניות8ו חסין תקנה9. מחקרים אחרונים שהיו בשימוש schistosomes 10,שני mansoni עלקת הבילהרציה (S. mansoni)11 ו ס japonicum12 הראו, למבוגרים schistosomes מפרישים exosome דמויי שלפוחית שעשויים להיות מעורב בהוראות פונקציונלי של תהליכים ביולוגיים ספציפיים.

עד כה, היו בשימוש מספר שיטות כדי לבודד שלפוחית חוץ-תאית, כגון ultracentrifugation, אולטראפילטרציה13, השימוש של ריאגנטים מבוסס פולימר, גודל-הדרה, ו- immunoaffinity בידוד. אלה שיטות שונות בעלי משלהם-יתרונות ומגבלות14. באופן כללי, ultracentrifugation נחשב לשיטת תקן הזהב שלפוחית בידוד. עם זאת, שיטה זו סובל המגבלה של EV פוטנציאליות צבירה14.

ב- schistosomes, כמה שיטות דווחו לבידוד EV: אלה כוללים את השימוש המסחרי EV בידוד ערכת16 עבור מספר שלבים (ביצים16,12,11,ultracentrifugation10 schistosomula11,12,10,schistosomes בוגרים17). בהתחשב בעובדה. שלפוחיות זעירות הן של מגוון רחב של גודל בין ננומטרים מאות אלפי ננומטר, פיתחנו שיטה חלופית המשלבת עם השימוש של ספסל צנטריפוגה אולטראפילטרציה, ערכת בידוד EV מסחרית כדי לבודד את EVs מ עלקת הבילהרציה japonicumלמבוגרים. EVs מבודד בדרך כלל בעל קוטר של 100-400 ננומטר, הופנמו בהצלחה על ידי תאים הנמען.

Protocol

ניסויים בבעלי חיים כל אושרו על ידי ועדת האתיקה המקומית של מכון מחקר וטרינרי שנגחאי, האקדמיה הסינית למדעים חקלאי (מספר היתר: SHVRIAU-14-0101). 1. תרבות במבחנה של Schistosomes הערה: Schistosomes מייצגים של חומרים מסוכנים. העובדים יש ללבוש כפפות גומי בכלל פעמי?…

Representative Results

כדי לכמת את התשואה של SjEVs מבודדים באמצעות פרוטוקול המתואר, השתמשנו BCA חלבון assay כדי לגשת ריכוז חלבון SjEVs מבודדים schistosomes למבוגרים 28 יום. כפי שמוצג בטבלה 1, ריכוז חלבון SjEV נע בין 208 µg אל µg 250 לכל 100 מ של מדיום (טבלה 1). גודל החלקיקים, כפי שנקבע על ידי ניתוח nanoparticle …

Discussion

מחקרים שנעשו לאחרונה על EVs הוכיחו את schistosome ש-evs לשחק תפקיד חשוב בפתוגן-פונדקאי אינטראקציות3,9,12,16. כתובת נוספת פונקציות התקינה שלהם, זה חיוני כדי לבודד EVs מן schistosomes. כאן, אנו מתארים שיטה חלופית עבור בידוד SjEV. שיטה זו מניבה ב…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

מחקר זה היה, בחלקו או במלואו, נתמך על ידי הלאומי מדעי הטבע קרן של סין (31472187 ו- 31672550), אגרונומיה ו תוכנית חדשנות טכנולוגית של האקדמיה הסינית למדעי החקלאות.

Materials

Material
Total Exosome Isolation Reagent (from cell culture media) ThermoFisher SCIENTIFIC 4478359 For isolating S. japonicum extracellular vesicles
PKH67 Sigma-aldrich MINI67 For labeling Evs
RPMI 1640 Medium ThermoFisher SCIENTIFIC 11875119 For parasite culture
Penicillin-Streptomycin ThermoFisher SCIENTIFIC 15140122
0.22μm syringe filter Merck SLGP033RB
SnakeSkin Dialysis Tubing Thermo SCIENTIFIC 68035
PEG8000 Sangon Biotech A100159 
RIPA Beyotime P0013B
EMD Millipore™ Immobilon™ Western Chemiluminescent HRP Substrate (ECL) Fisher scientific WBKLS0100 
DAPI Cell Signaling Technology 4083
BCA kit Beyotime P0010
CD63 antibodies Sangon Biotech D160973-0025
PVDF Bio-Rad 1704273
Formvar/Carbon 400 mesh Ted Pella 01754-F
Phosphotungstic Acid Ted Pella 19402
anti-mouse IgG-HRP CWBIO CW0102
NCTC clone 1469 cells ATCC ATCC® CCL-9.1™
FBS HyClone SV30087.02
Equipments
GE chemoluminescance imaging system GE ImageQuant LAS4000mini
Transmission electron microscopy Hitachi H-7600
Milli-Q water Milli-Q Milli-Q Elix
Eppendor Centrifuge  Eppendorf Centrifuge 5804R
Zetasizer Nano Malvern Zetasizer Nano ZS 
Ultracentrifuge Beckman Optima L-100 XP Ultracentrifuge
Incubator ESCO CCL-107B
Microscope Zeiss Zeiss Axin Observer Z1

References

  1. Tetta, C., Ghigo, E., Silengo, L., Deregibus, M. C., Camussi, G. Extracellular vesicles as an emerging mechanism of cell-to-cell communication. Endocrine. 44 (1), 11-19 (2013).
  2. Abels, E. R., Breakefield, X. O. Introduction to Extracellular Vesicles: Biogenesis, RNA Cargo Selection, Content, Release, and Uptake. Cell Mol Neurobiol. 36 (3), 301-312 (2016).
  3. Riaz, F., Cheng, G. Exosome-like vesicles of helminths: implication of pathogenesis and vaccine development. Ann Transl Med. 5 (7), 175 (2017).
  4. Zhang, H. G., Grizzle, W. E. Exosomes and cancer: a newly described pathway of immune suppression. Clin Cancer Res. 17 (5), 959-964 (2011).
  5. Colombo, M., Raposo, G., Thery, C. Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles. Annu Rev Cell Dev Biol. 30, 255-289 (2014).
  6. Li, Y., et al. Circular RNA is enriched and stable in exosomes: a promising biomarker for cancer diagnosis. Cell Res. 25 (8), 981-984 (2015).
  7. Marcilla, A., et al. Extracellular vesicles in parasitic diseases. J Extracell Vesicles. 3, 25040 (2014).
  8. Cwiklinski, K., et al. The Extracellular Vesicles of the Helminth Pathogen, Fasciola hepatica: Biogenesis Pathways and Cargo Molecules Involved in Parasite Pathogenesis. Mol Cell Proteomics. 14 (12), 3258-3273 (2015).
  9. Buck, A. H., et al. Exosomes secreted by nematode parasites transfer small RNAs to mammalian cells and modulate innate immunity. Nat Commun. 5, 5488 (2014).
  10. Sotillo, J., et al. Extracellular vesicles secreted by Schistosoma mansoni contain protein vaccine candidates. Int J Parasitol. 46 (1), 1-5 (2016).
  11. Nowacki, F. C., et al. Protein and small non-coding RNA-enriched extracellular vesicles are released by the pathogenic blood fluke Schistosoma mansoni. J Extracell Vesicles. 4, 28665 (2015).
  12. Wang, L., et al. Exosome-like vesicles derived by Schistosoma japonicum adult worms mediates M1 type immune- activity of macrophage. Parasitol Res. 114 (5), 1865-1873 (2015).
  13. Koh, Y. Q., Almughlliq, F. B., Vaswani, K., Peiris, H. N., Mitchell, M. D. Exosome enrichment by ultracentrifugation and size exclusion chromatography. Front Biosci (Landmark Ed). 23, 865-874 (2018).
  14. Safdar, A., Saleem, A., Tarnopolsky, M. A. The potential of endurance exercise-derived exosomes to treat metabolic diseases. Nat Rev Endocrinol. 12 (9), 504-517 (2016).
  15. Livshits, M. A., et al. Isolation of exosomes by differential centrifugation: Theoretical analysis of a commonly used protocol. Sci Rep. 5, 17319 (2015).
  16. Zhu, S., et al. Release of extracellular vesicles containing small RNAs from the eggs of Schistosoma japonicum. Parasit Vectors. 9 (1), 574 (2016).
  17. Zhu, L., et al. Molecular characterization of S. japonicum exosome-like vesicles reveals their regulatory roles in parasite-host interactions. Sci Rep. 6, 25885 (2016).
  18. Lewis, F. Schistosomiasis. Curr Protoc Immunol. , 11 (2001).
  19. Cheng, G. Circulating miRNAs: roles in cancer diagnosis, prognosis and therapy. Adv Drug Deliv Rev. 81, 75-93 (2015).

Play Video

Cite This Article
Liu, J., Zhu, L., Wang, L., Chen, Y., Giri, B. R., Li, J., Cheng, G. Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles from Adult Schistosoma japonicum. J. Vis. Exp. (135), e57514, doi:10.3791/57514 (2018).

View Video