Summary

Isolement et caractérisation des vésicules extracellulaires d’adultes Schistosoma japonicum

Published: May 22, 2018
doi:

Summary

Nous présentons ici un protocole visant à décrire l’isolement vésicules extracellulaires (EVs) en milieu de cultivés in vitro des adultes Schistosoma japonicum.

Abstract

Vésicules extracellulaires (EVs) sont des vésicules membranaires libérés par une variété de cellules dans le microenvironnement extracellulaire. Véhicules électriques représentent une population de vésicules hétérogènes, dont calibre compris entre 40 et 1 000 nm. Données accumulées ont indiqué que EVs jouent un rôle réglementaire important dans les interactions hôte-pathogène. Une compréhension profonde du schistosome SVE doit donner un aperçu les mécanismes qui sous-tendent les interactions de schistosomes-hôte, permettant ainsi le développement de nouvelles stratégies de lutte contre la schistosomiase. Ici, nous visons à étudier davantage les fonctions EVs dans schistosomes en présentant un protocole pour l’isolement et la caractérisation des véhicules électriques du adult Schistosoma japonicum (S. japonicum). EVs ont été isolées in vitro milieu de culture par centrifugation, combinée avec un kit d’isolation exosome commerciale. L’ isolé S. japonicum EVs (SjEVs) généralement posséder un diamètre de 100 à 400 nm et sont caractérisées par la microscopie électronique à transmission et transfert Western. L’utilisation de PKH67 dye-labeled SjEVs a démontré que les SjEVs sont internalisés par les cellules réceptrices. Dans l’ensemble, notre protocole fournit une méthode alternative pour isoler l’EVs de schistosomes adultes ; la SjEVs isolée peut être adapté à l’analyse fonctionnelle.

Introduction

Les vésicules extracellulaires (EVs) sont une population de petites vésicules membranaires encapsulé avec diverses protéines, lipides et acides nucléiques. Des études récentes ont démontré que EVs jouent un rôle crucial dans la communication de cellule-cellule et sont impliquées dans la régulation de nombreux processus physiologiques, y compris le développement cellulaire, régulation immunitaire, angiogenèse et cell migration2, 3,4,5. Accumulation de preuves indique que EVs, diffuser les exosomes et leur cargaison de miRNA représentent des biomarqueurs potentiels de certaines maladies6.

Plusieurs des protozoaires tels que Trichomonas vaginalis, Trypanosoma cruziet Leishmania spp., auraient dû être divulgués pour pouvoir sécréter EVs ; helminthes ont en outre été découverts à sécréter des EVs en vie accueille7. EVs parasitaires ont démontré d’être impliqués dans le maintien de l’infection, pathogénicité8et9de la régulation immunitaire. Récentes études sur les schistosomes deux Schistosoma mansoni (S. mansoni) 10,11 et S. japonicum12 ont indiqué que les schistosomes adultes sécrètent exosome-comme des vésicules qui peuvent être impliqués dans la réglementation fonctionnelle des processus biologiques spécifiques.

A ce jour, plusieurs méthodes ont été utilisées pour isoler des vésicules extracellulaires, telles que l’ultracentrifugation, ultrafiltration13, l’utilisation de réactifs à base de polymère, chromatographie d’exclusion et l’isolement d’immuno-affinité. Ces différentes méthodes possèdent leurs propres avantages et limitations14. En règle générale, ultracentrifugation est considérée comme la méthode de l’étalon-or pour l’isolement de la vésicule. Toutefois, cette méthode souffre de la limitation de potentiel EV agrégation14.

Dans schistosomes, deux méthodes ont été signalés pour l’isolement de l’EV : il s’agit d’ultracentrifugation11,12,10 et l’utilisation commerciale EV isolation kit16 pour plusieurs stades (œufs,16, schistosomula11, schistosomes adultes10,12,,17). Étant donné que microvésicules sont d’une large gamme de taille de quelques nanomètres de cent à mille nanomètres, nous avons développé une méthode alternative qui associe l’utilisation d’un kit d’isolation commercial EV pour isoler le SVE de centrifugeuse de paillasse et ultrafiltration adultes de Schistosoma japonicum. Le SVE isolé en général possède un diamètre de 100 à 400 nm et ont été avec succès internalisé par les cellules réceptrices.

Protocol

Toutes les expériences animales ont été approuvées par le Comité d’éthique local de l’Institut de recherche vétérinaire de Shanghai, Académie chinoise des Sciences agricoles (numéro de permis : SHVRIAU-14-0101). 1. la Culture in Vitro des Schistosomes Remarque : Schistosomes représentent un danger biologique. Travailleurs devraient porter des gants en latex à tous les temps quelle manipulation vers, des sus…

Representative Results

Afin de quantifier le rendement de SjEVs isolé en utilisant le protocole décrit, nous avons utilisé dosage protéique BCA pour accéder le taux protéique de la SjEVs isolée de schistosomes adultes de 28 jours. Comme indiqué dans le tableau 1, la concentration de protéine chadhouli variait entre 208 µg et 250 µg / 100 mL de milieu (tableau 1). La taille des particules, tel que déterminé par analyse de nanoparticules de Malvern, a indiqué que le…

Discussion

Des études récentes sur les EVs ont démontré que schistosome Qu’evs jouent un rôle important dans host-pathogen interactions3,9,12,16. Afin de répondre leurs fonctions de régulation, il est essentiel d’isoler le SVE de schistosomes. Nous décrivons ici une autre méthode d’isolement chadhouli. Cette méthode génère une taille de large gamme de SjEVs, de 100 nm à 400 nm, en adulte …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Cette étude a été, en partie ou en totalité, soutenu par la Fondation de sciences naturelles nationales de la Chine (31472187 et 31672550) et The Agricultural Science et Technology Innovation Program de l’Académie chinoise des Sciences agricoles.

Materials

Material
Total Exosome Isolation Reagent (from cell culture media) ThermoFisher SCIENTIFIC 4478359 For isolating S. japonicum extracellular vesicles
PKH67 Sigma-aldrich MINI67 For labeling Evs
RPMI 1640 Medium ThermoFisher SCIENTIFIC 11875119 For parasite culture
Penicillin-Streptomycin ThermoFisher SCIENTIFIC 15140122
0.22μm syringe filter Merck SLGP033RB
SnakeSkin Dialysis Tubing Thermo SCIENTIFIC 68035
PEG8000 Sangon Biotech A100159 
RIPA Beyotime P0013B
EMD Millipore™ Immobilon™ Western Chemiluminescent HRP Substrate (ECL) Fisher scientific WBKLS0100 
DAPI Cell Signaling Technology 4083
BCA kit Beyotime P0010
CD63 antibodies Sangon Biotech D160973-0025
PVDF Bio-Rad 1704273
Formvar/Carbon 400 mesh Ted Pella 01754-F
Phosphotungstic Acid Ted Pella 19402
anti-mouse IgG-HRP CWBIO CW0102
NCTC clone 1469 cells ATCC ATCC® CCL-9.1™
FBS HyClone SV30087.02
Equipments
GE chemoluminescance imaging system GE ImageQuant LAS4000mini
Transmission electron microscopy Hitachi H-7600
Milli-Q water Milli-Q Milli-Q Elix
Eppendor Centrifuge  Eppendorf Centrifuge 5804R
Zetasizer Nano Malvern Zetasizer Nano ZS 
Ultracentrifuge Beckman Optima L-100 XP Ultracentrifuge
Incubator ESCO CCL-107B
Microscope Zeiss Zeiss Axin Observer Z1

References

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Cite This Article
Liu, J., Zhu, L., Wang, L., Chen, Y., Giri, B. R., Li, J., Cheng, G. Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles from Adult Schistosoma japonicum. J. Vis. Exp. (135), e57514, doi:10.3791/57514 (2018).

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