Здесь мы описываем метод для создания трехмерных сфероида культур человеческого носа эпителиальных клеток. Сфероидов затем стимулируются диск муковисцидоз регулятор трансмембранной проводимости (МВТР)-зависимых ионных и жидкости секреции, количественная оценка изменения в размер Люминал сфероида как прокси для МВТР функции.
В то время как введение препаратов модулятор муковисцидоз регулятор трансмембранной проводимости (МВТР) революционизировало ухода в кистозный фиброз (CF), в настоящее время модель генотип направленных терапии имеет ряд ограничений. Первый, редких или малоисследованный мутации групп исключены из окончательного клинических испытаний. Кроме того как дополнительные модулятор наркотиков на рынок, он станет трудно оптимизировать выбор модулятор для отдельного субъекта. Обе эти проблемы решаются с использованием систем пациента производные, индивидуальный доклинических модель МВТР функции и модуляции. Носовые эпителиальных клеток человека (HNEs) являются легкодоступным источником дыхания ткани для такой модели. Здесь мы описываем поколения модели трехмерных сфероида МВТР функции и модуляция с помощью первичных HNEs. HNEs изолированы от предметов в минимально инвазивной моды, расширена в условной перепрограммирования условиях и посеяны в сфероида культуры. В течение 2 недель посева культур сфероида генерировать сфероидов HNE, которые могут стимулировать с 3′, 5′-циклический аденозинмонофосфат (лагерь)-генерации агонисты для активации функции МВТР. Сфероида опухоль затем количественно как прокси МВТР деятельности. HNE сфероидов капитализировать минимально инвазивной, но дыхательных происхождения носовой клетки для создания доступной, персонализированные модели, имеющих отношение к эпителия, отражающие болезней заболеваемости и смертности. По сравнению с воздуха жидкость интерфейс HNE культур, сфероидов относительно быстро созреть, что снижает общий уровень загрязнения. В его нынешнем виде модель ограничивается низкой пропускной способности, однако это компенсируется относительной легкости приобретения тканей. HNE сфероидов может использоваться для количественной оценки и надежно характеризуют МВТР деятельности на индивидуальном уровне. Текущие исследования связать это количественная оценка в vivo ответ наркотиков определит если HNE сфероидов истинный доклинических предиктором реакции больного на МВТР модуляции.
Кистозный фиброз (CF) является фатальным, аутосомно-рецессивный заболевание, которое поражает свыше 70 000 человек во всем мире1. Эта жизнь укорочение генетическое заболевание вызвано мутациями в кистозный фиброз трансмембранной проводимости регулятор белка (МВТР)2. МВТР является членом семьи кассеты аденозинтрифосфат привязки, и функций как ионного канала, позволяя движение хлора и бикарбоната через Апикальное мембраны нескольких поляризованные эпителия, включая желудочно-кишечного тракта, потовых желез, и дыхательные дерево, среди прочих3,4. Таким образом дисфункциональные МВТР приводит к мультисистемный эпителиальных дисфункции, с большинство смертности, обусловленной респираторных заболеваний1. В легких CF, потерей МВТР driven сократимость поверхности жидкости (ASL) регулирование и слизи релиз приводит к утолщенные слизи, обструкции дыхательных путей, хронической инфекции и прогрессивного сократимость ремоделирования и легких функция1,5.
Несмотря на выявление МВТР дисфункции как причина болезни терапии в CF традиционно ориентировалась на смягчение симптомов (например, поджелудочной ферменто-заместительную терапию, сократимость Распродажа терапии)1. Этот подход был недавно произвел революцию, появлением новых терапевтов, называют «МВТР модуляторы, «которые предназначены непосредственно для неблагополучных МВТР. Этот подход сместился клинических пейзаж с симптом управления Болезнь модифицирующие уход, но носит несколько ограничений6,,78,9,10. Модулятор деятельности конкретного дефекта белка, сопровождающие каждый МВТР мутации и ограничивается выбрать генетических населения11. Это ограничение определяется неоднородный характер дефектов белка, но и с непрактичности клинических испытаний в редкой мутации групп. Кроме того среди предметов с хорошо изученных генотипов (например, F508del/F508del МВТР, наиболее распространенных МВТР мутации), есть большой изменчивости в болезни бремя и модулятор ответ6,7,8 ,9,11.
Чтобы преодолеть обе эти проблемы, следователи предложил использовать персонализированные модели для доклинических испытаний12. Эта концепция использует ткани пациента специфичные для создания индивидуализированных ex vivo модель системы для тестирования соединения, прогнозирования в vivo ответ тему терапии в персонализированные образом. После проверки, такая модель может использоваться клиницистам диск точность терапии независимо от базовой МВТР генотипа пациента.
Человека бронхиальной эпителиальных клеток (HBE), полученные от экспланта ткани во время пересадки легких предусматривает возможность такой модели для CF13,14. HBEs, выращенных на интерфейс воздуха жидкость (Али) позволяют функциональных МВТР количественной оценки непосредственно через электрофизиологическое тестирования или косвенно мер ASL гомеостаза13,15. Эта модель имеет чрезвычайно важное значение для понимания МВТР биологии и было ключевым фактором в развитии МВТР модуляторы16. К сожалению HBE модели не являются прочными как персонализированные модели вследствие захватнический характер приобретения (пересадка легкого или бронхиальной щеткой) и отсутствие образцов для тех, кто с редкой мутации или легкое заболевание. И наоборот кишечных тканей, полученных от ректального или двенадцатиперстной биопсии образцов, может использоваться для кишечных измерения тока (ICM) или на основе опухоль органоид пробирного для изучения индивидуального МВТР функция17,18, 19. органоид анализы, в частности, являются очень чувствительных моделей МВТР деятельности20,21,22. Обе модели ограничены ткани источника (кишечные ткани, в то время как большинство болезней патологии органов дыхания) и полу инвазивный метод приобретения. Кроме того некоторые следователи изучили человеческого носа эпителиальных клеток (HNE) до модели МВТР реставрации23,24,25. HNEs могут быть безопасно собраны кистью или выскабливание предметам любого возраста и, когда культивировали в Али, пилки многие характеристики HBEs25,26,27,28. HNE монослой культуры традиционно были ограничены плоскоклеточный трансформации и долгое время до погашения29. Кроме того, сообщил короткого замыкания измерения токов в HNEs меньше, чем в HBEs, предлагая меньше окно для обнаружения терапевтической эффективности25.
Учитывая необходимость персонализированные, неинвазивный, дыхательной техники культуры тканей модели МВТР функции, мы стремились объединить чувствительность основанные на опухоль, пробирного органоид с неинвазивные и дыхательных характер HNEs. Здесь мы описываем наш метод генерации 3-мерной «сфероиде» культур HNEs для индивидуального изучения МВТР в опухоль на основе анализа30. HNE сфероидов поляризовывайте надежно с эпителиального Апекс к сфере центр, или люмен. Эта модель перечисляет многочисленные характеристики ниже эпителия дыхательных и созревает быстрее, чем Али культур. Как функционального анализа HNE сфероидов надежно количественно спектр МВТР функции, а также модуляции в хорошо изученных мутации групп (например, F508del МВТР). Этот assay, основанные на опухоль капитализирует на Ион/соль транспортных свойств МВТР, косвенно измерения приток жидкости в сфероида следующим апикальной соли измеряем воды. Таким образом стимулируется сфероидов с полностью функциональный МВТР зыбь надежно, в то время как те, с неблагополучной МВТР зыбь меньше или сжать. Это количественно посредством предварительного анализа изображений и 1 час после стимуляции сфероидов, измерения Люминал области и определения процент изменения. Эта мера можно сравнить экспериментальных групп экран для отпорности наркотиков в форме конкретного пациента.
Этот протокол описывает поколения пациента производные носовой клеточных культур сфероида способен производить индивидуальное, конкретные модели МВТР функции. Есть несколько основных шагов в процессе, который должен быть тесно присутствовали чтобы избежать трудностей. Во-первых, эт…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана фонд терапия муковисцидоза, предоставьте номер CLANCY14XX0, а через Фонд муковисцидоз, номер CLANCY15R0. Авторы хотели бы поблагодарить Кристина Рэй за ее помощь в пациента набора и нормативного надзора. Авторы хотели бы также поблагодарить HNE Рабочей группы, поддержанные Фондом кистозный фиброз, который помогал в поколении HNE культуры возможностей: Престон Bratcher, Calvin хлопок, Мартина Gentzsch, Элизабет Joseloff, Майкл Myerburg, Дэйв Николс, Скотт Randell, Стив Роу, G. Марти Соломон и Кэтрин Таггл.
1.5 mL Eppendorf Tube | USA Scientific | 4036-3204 | |
150 mL Filter Flask | Midsci | TP99150 | To filter Media |
15 mL Conical Tube | Midsci | TP91015 | |
1 L Filter Flask | Midsci | TP99950 | To filter Media |
35 mm Glass-Bottom Dish | MatTek Corporation | P35G-0-20-C | Optional |
3-Isobutyl-1-Methylxanthine (IBMX) | Fisher Scientific | AC228420010 | Prepare a 100 mM stock solution of 22.0 mg in 1 mL of DMSO |
50 mL Conical Tube | Midsci | TP91050 | |
Accutase | Innovative Cell Technologies, Inc. | AT-104 | Cell detachment solution |
Adenine | Sigma-Aldrich | A2786-25G | See Table 1 |
Amphotericin B | Sigma-Aldrich | A9528-100MG | See Table 1 |
Bovine Brain Extract (9mg/mL) | Lonza | CC-4098 | See Table 2 |
Ceftazidime hydrate | Sigma-Aldrich | C3809-1G | See Table 1 |
Cell Scrapers 20 cm | Midsci | TP99010 | |
CFTR Inh172 | Tocris Bioscience | 3430 | Prepare a 10 mM stock solution of 4.0 mg in 1 mL of DMSO |
Cholera Toxin B (From Vibrio cholerae) | Sigma-Aldrich | C8052-.5MG | See Table 1 |
CYB-1 | Medical Packaging Corporation | CYB-1 | Cytology brush |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D5879-500ML | |
Dulbecco's Modified Eagle Media (DMEM)/F12 Hepes | Life Technologies | 11330-057 | Base Medium; See Tables 1 and 2 |
Epidermal Growth Factor (Recombinant Human Protein, Animal-Origin Free) | Thermo Fisher Scientific | PHG6045 | See Table 1 |
Epinephrine | Sigma-Aldrich | E4250-1G | See Table 2 |
Ethanol | Fisher Scientific | 2701 | |
Ethanolamine | Sigma-Aldrich | E0135-500ML | 16.6 mM solution; See Table 2 |
Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA) | TCI America | E0084 | |
Fetal Bovine Serum (high performance FBS) | Invitrogen | 10082147 | See Table 1 |
Forskolin | Sigma-Aldrich | F6886-50 | Prepare a 10 mM stock solution of 4.1 mg in 1 mL of DMSO |
Growth Factor-Reduced Matrigel | Corning, Inc. | 356231 | Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, Phenol Red-Free, LDEV-Free, 10 mL. |
Hemacytometer | Hausser Scientific | 1483 | |
Human Collagen Solution, Type I (VitroCol; 3 mg/mL) | Advanced BioMatrix | 5007-A | Collagen solution |
HyClone (aka FetalClone II) | GE Healthcare | SH30066.03HI | See Table 2 |
Hydrocortisone | StemCell Technologies | 07904 | See Tables 1 and 2 |
Insulin, human recombinant, zinc solution | Life Technologies | 12585014 | 4 mg/mL solution; see Table 2 |
IVF 4-Well Dish, Non-treated | NUNC (via Fisher Scientific) | 12566350 | 4-well plate for spheroids; similar well size to a 24-well plate |
MEF-CF1-IRR | Globalstem | GSC-6001G | Irradiated murine embryonic fibroblasts |
Metamorph 7.7 | Molecular Devices | Analysis Software; https://www.moleculardevices.com/systems/metamorph-research-imaging/metamorph-microscopy-automation-and-image-analysis-software for a quote | |
Olympus IX51 Inverted Microscope | Olympus Corporation | Discontinued | Imaging Microscope. Replacment: Olympus IX53, https://www.olympus-lifescience.com/pt/microscopes/inverted/ix53/ for a quote |
Pen Strep | Life Technologies | 15140122 | See Table 2 |
Phsophoryletheanolamine | Sigma-Aldrich | P0503-5G | See Table 2 |
Retinoic Acid | Sigma-Aldrich | R2625-50MG | See Table 2 |
Rhinoprobe | Arlington Scientific, Inc. | 96-0905 | Nasal curette |
Slidebook 5.5 | 3i, Intelligent Imaging Innovations | Discontinued | Imaging Software. Replacement: Slidebook 6, https://www.intelligent-imaging.com/slidebook for a quote |
Sterile Phosphate Buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 20012050 | |
Sterile Water | Sigma-Aldrich | W3500-6X500ML | |
Tissue Culture Dish 100 | Techno Plastic Products | 93100 | Tissue culture dish for expansion |
Tobramycin | Sigma-Aldrich | T4014-100MG | See Table 1 |
Transferrin (Human Transferrin 0.5 mL) | Lonza | CC-4205 | See Table 2 |
Triiodothryonine | Sigma-Aldrich | T6397-1G | 3,3′,5-Triiodo-L-thyronine sodium salt [T3]; See Table 2 |
Trypsin from Porcine Pancreas | Sigma-Aldrich | T4799-10G | |
Ultroser-G | Crescent Chemical (via Fisher Scientific) | NC0393024 | 20 mL lypophilized powder; See Table 2 |
Vancomycin hydrochloride from Streptomyces orientalis | Sigma-Aldrich | V2002-5G | See Table 1 |
VX770 | Selleck Chemicals | S1144 | Prepare a 1 mM stock solution of 0.4 mg in 1 mL of DMSO |
VX809 | Selleck Chemicals | S1565 | Purchase or prepare a 10 mM stock solution of 4.5 mg in 1 mL of DMSO |
Y-27632 Dihydrochloride ROCK inhibitor | Enzo LifeSciences | ALX-270-333-M025 | See Table 1 |