כאן אנו מתארים שיטה להפקת ספרואיד תלת מימדי התרבויות של תאי אפיתל באף אדם. Spheroids הם גירוי ואז לנהוג סיסטיק פיברוזיס Transmembrane מוליכות הרגולטור (CFTR)-יון התלויים, הפרשת נוזלים, לכימות בשינוי הגודל luminal ספרואיד כמדד עבור פונקציה CFTR.
בזמן כניסתה של סיסטיק פיברוזיס Transmembrane מוליכות הרגולטור (CFTR) אפנן סמים יש מהפכה טיפול ב סיסטיק פיברוזיס (CF), המודל טיפול מכוון גנוטיפ הנמצאות כעת בשימוש יש מספר מגבלות. המוטציה הראשונה, נדיר או understudied קבוצות לא יכללו מניסויים קליניים סופית. יתר על כן, כמו סמים אפנן נוספים להיכנס לשוק, יהפוך קשה למטב את הבחירות אפנן עבור נושא בודדים. שתי בעיות אלו מטופלות עם השימוש של מערכות נגזר החולה, תגובותיהם דגם פרה CFTR פונקציה, אפנון. תאי אפיתל באף אדם (HNEs) הם מקור נגיש בקלות של רקמות הנשימה מודל כזה. במסמך זה, אנו מתארים את הדור של מודל תלת מימדי ספרואיד של CFTR ותפקוד אפנון באמצעות HNEs הראשי. HNEs מבודדים מן הנבדקים בצורה פולשנית, מותנה בתנאי התיכנות, ושדרות נזרע לתוך התרבות ספרואיד. בתוך 2 שבועות של זריעה, ספרואיד תרבויות ליצור spheroids HNE זה יכול להיות מגורה עם 3′, אדנוזין 5′-מחזורית monophosphate (מחנה)-יצירת אגוניסטים כדי להפעיל פונקציה CFTR. ספרואיד נפיחות לאחר מכן לכמת כמדד לפעילות CFTR. HNE spheroids לנצל מקור פולשנית, עדיין הנשימה לתאי האף כדי ליצור מודל נגיש, אישית הרלוונטיים האפיתל המשקף המחלה התחלואה והתמותה. לעומת התרבויות HNE אוויר נוזלי ממשק, spheroids הם מהיר יחסית להבשיל, אשר מפחית את שיעור הזיהום הכולל. במתכונתה הנוכחית, הדגם הוא מוגבל על ידי תפוקה נמוכה, למרות זה קוזז על ידי הקלות היחסית רקמות רכישה. HNE spheroids יכול לשמש כדי לכמת באופן אמין ולאפיין CFTR פעילות ברמת הפרט. לימוד מתמשך לקשור את כימות ויוו סמים לתגובה יקבע אם HNE spheroids הם מנבא פרה אמיתי של המטופל בתגובה CFTR אפנון.
סיסטיק פיברוזיס (CF) היא מחלה רצסיבי קטלנית, אוטוזומלית משפיע על יותר מ 70,000 אנשים ברחבי העולם1. זו מחלה גנטית של החיים-לקיצור נגרמת על ידי מוטציות בגן מוליכות Transmembrane סיסטיק פיברוזיס הרגולטור חלבון (CFTR)2. CFTR הוא חבר של המשפחה קלטת אדנוזין טריפוספט מחייב, וכן פונקציות כערוץ יון המאפשר תנועה של ביקרבונט הכלוריד על פני הממברנות הפסגה של epithelia מקוטב מרובים כולל של מערכת העיכול, בלוטות זיעה, מערכת הנשימה עץ, בין היתר3,4. ככזה, CFTR לקוי מוביל מכשל בתפקוד אפיתל, עם רוב תמותת הנובעות מחלות נשימה1. CF בריאה, אובדן של דרכי הנשימה מונחה-CFTR משטח נוזלי (ASL) תקנה, ריר שחרור מוביל ריר מעובה, חסימה בדרכי הנשימה, דלקת כרונית, ו שיפוץ דרכי הנשימה מתקדמת ואובדן של הריאה פונקציה1,5.
למרות הזיהוי של תפקוד CFTR סיבת המחלה, טיפולים ב- CF התמקדו באופן מסורתי להפחתת התסמינים (למשל, טיפול בתחליפי האנזים בלבלב, דרכי הנשימה סיווג טיפולים)1. גישה זו הייתה מהפכה לאחרונה על ידי הופעתו של הריפוי, כינה “CFTR מאפננים,” שמכוון ישירות CFTR לקוי. גישה זו עברה הנוף קליני של ניהול סימפטום למחלות שינוי מעניין אבל נושאת מספר מגבלות6,7,8,9,10. פעילות אפנן היא ספציפית הפגם חלבון המלווה כל מוטציה CFTR מוגבל לבחירת אוכלוסיות גנטי11. מגבלה זו מונעת על ידי הטבע הטרוגנית של חלבון פגמים, אלא גם את טענותיהם של ניסויים קליניים בקבוצות מוטציה נדירה. בנוסף, בין נושאים עם למד היטב אחרים (למשל, F508del/F508del CFTR, המוטציה CFTR הנפוץ ביותר), יש השתנות רחב במחלת נטל, אפנן תגובה6,7,8 9, ,11.
כדי להתגבר על שתי בעיות אלו, חוקרים הציעו את השימוש הדגמים מותאמים אישית עבור בדיקה פרה12. המושג הזה מנצל החולה הספציפי רקמות כדי ליצור מערכת מודל בפעוט שמחוץ בדיקה מורכבת, חיזוי ויוו נושא התגובה לטיפולים בצורה אישית. לאחר האימות, מודל כזה יכול לשמש על ידי רופאים לטיפול דיוק נסיעה בין גנוטיפ CFTR הבסיסית של המטופל.
האדם הסימפונות (HBE) בתאי אפיתל המתקבל explant רקמות בזמנו של השתלת הריאות הקים את האפשרות של כזה דגם CF13,14. HBEs גדל ממשק אוויר נוזלי (עלי) מאפשרים פונקציונלי כימות CFTR ישירות באמצעות בדיקות electrophysiologic או בעקיפין באמצעות מדדי ASL הומאוסטזיס13,15. מודל זה כבר קריטי להבנת CFTR בביולוגיה, היה נהג מפתח בהתפתחות CFTR מאפננים16. למרבה הצער, מודלים HBE אינם בביאולוגיה כמודל אישית בשל העיקרון החודרני של רכישה (השתלת הריאות או צחצוח הסמפונות) וחוסר דוגמאות עבור אלה עם מוטציות נדירות או מחלה קלה. לעומת זאת, רקמת המעי, המתקבל דגימות ביופסיה רקטאלית או תריסריון, ניתן למדידה הנוכחי מעיים (ICM) או assay תא צורב מבוסס-נפיחות ללמוד בפעוט CFTR פונקציה17,18, 19. מבחני תא צורב, בפרט, הם מאוד רגישים דגמי CFTR פעילות20,21,22. שני הדגמים מוגבלים על ידי מקור רקמות (רקמת המעי, אמנם רוב המחלה פתולוגיה במערכת הנשימה) ושיטת רכישת פולשנית למחצה. לחלופין, מספר חוקרים חקרו האנושי האף (HNE) תאים אפיתל דגם CFTR שיקום23,24,25. HNEs ניתן לקצור בבטחה על ידי מברשת או גרידה נושאים בכל גיל, כאשר תרבותי ב עלי, לסכם מאפיינים רבים של HBEs25,26,27,28. HNE חד שכבתי תרבויות באופן מסורתי הייתה מוגבלת על-ידי שינוי קשקשיים, הרבה זמן הפירעון29. יתר על כן, דיווח קצר מידות הנוכחי HNEs הם קטנים יותר מאלו HBEs, רומז חלון קטן יותר כדי לזהות יעילות טיפולית25.
בהתחשב בצורך מודל תרביות רקמה אישית, לא פולשנית, הנשימה של הפונקציה CFTR, חיפשנו למזג את רגישות assay תא צורב מבוסס-נפיחות, עם אופי פולשני, מערכת הנשימה HNEs. כאן, אנו מתארים את השיטה שלנו של יצירת תלת-ממדי “ספרואיד” תרבויות HNEs למחקר CFTR תגובותיהם ב- מבוסס-נפיחות assay30. HNE spheroids polarize אמינה בעלת אפיתל לכיוון מרכז כדור, או לומן. מודל זה recapitulates מאפיינים רבים אפיתל בדרכי הנשימה התחתונה, מתפתח במהירות רבה יותר מאשר עלי תרבויות. כמו assay פונקציונלי, HNE spheroids לכמת באופן אמין עם טווח של CFTR פונקציה, וכן אפנון בקבוצות מוטציה למד היטב (למשל, F508del CFTR). זה וזמינותו המבוסס על נפיחות יהפוך לרישית על מאפייני התחבורה יון/מלח CFTR, בעקיפין מדידת זרם נוזלים לתוך ספרואיד המים כדלקמן בזרימת מלח הפסגה. בצורה כזאת, spheroids מגורה עם CFTR המתפקד במלואו להתנפח robustly, בעוד אלה עם תפקוד לקוי CFTR להתנפח פחות או לכווץ. זה הוא לכמת באמצעות ניתוח תמונות של טרום ושנה 1 h פוסט-גירוי spheroids, מדידת שטח luminal וקביעת האחוזים. אמצעי זה ניתן להשוות אז קבוצות ניסיוני עבור סמים אתריים באופן ספציפי לחולה מסך.
פרוטוקול זה מתאר את הדור של תרבויות ספרואיד תא האף נגזר החולה מסוגל לייצר מודל בפעוט, מסוים של פונקציה CFTR. ישנם מספר שלבים מרכזיים בתהליך זה צריך להיות נוכחת מקרוב כדי למנוע קושי. ראשית הוא רכישת מדגם טוב מן האף של המטופל. דגימה טובה צריך > 50,000 תאים, מוגבל ריר/פסולת, ולהיות מוכן לעיבוד בתוך 4 ש…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי קרן סיסטיק פיברוזיס הרפוי, להעניק מספר CLANCY14XX0, דרך איגוד סיסטיק פיברוזיס, להעניק מספר CLANCY15R0. המחברים רוצים להודות קריסטינה ריי על הסיוע במתן החולה רגולטורי. המחברים גם רוצים להודות קבוצת העבודה HNE, נתמך על ידי קרן סיסטיק פיברוזיס, אשר סייעו בדור של HNE תרבות יכולות: פרסטון Bratcher, כותנה קלווין, מרטינה Gentzsch, אליזבת Joseloff, מייקל Myerburg, ניקולס דייב, סקוט רנדל, סטיב רואו, שלמה מרטי ג ו קתרין טאגל.
1.5 mL Eppendorf Tube | USA Scientific | 4036-3204 | |
150 mL Filter Flask | Midsci | TP99150 | To filter Media |
15 mL Conical Tube | Midsci | TP91015 | |
1 L Filter Flask | Midsci | TP99950 | To filter Media |
35 mm Glass-Bottom Dish | MatTek Corporation | P35G-0-20-C | Optional |
3-Isobutyl-1-Methylxanthine (IBMX) | Fisher Scientific | AC228420010 | Prepare a 100 mM stock solution of 22.0 mg in 1 mL of DMSO |
50 mL Conical Tube | Midsci | TP91050 | |
Accutase | Innovative Cell Technologies, Inc. | AT-104 | Cell detachment solution |
Adenine | Sigma-Aldrich | A2786-25G | See Table 1 |
Amphotericin B | Sigma-Aldrich | A9528-100MG | See Table 1 |
Bovine Brain Extract (9mg/mL) | Lonza | CC-4098 | See Table 2 |
Ceftazidime hydrate | Sigma-Aldrich | C3809-1G | See Table 1 |
Cell Scrapers 20 cm | Midsci | TP99010 | |
CFTR Inh172 | Tocris Bioscience | 3430 | Prepare a 10 mM stock solution of 4.0 mg in 1 mL of DMSO |
Cholera Toxin B (From Vibrio cholerae) | Sigma-Aldrich | C8052-.5MG | See Table 1 |
CYB-1 | Medical Packaging Corporation | CYB-1 | Cytology brush |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D5879-500ML | |
Dulbecco's Modified Eagle Media (DMEM)/F12 Hepes | Life Technologies | 11330-057 | Base Medium; See Tables 1 and 2 |
Epidermal Growth Factor (Recombinant Human Protein, Animal-Origin Free) | Thermo Fisher Scientific | PHG6045 | See Table 1 |
Epinephrine | Sigma-Aldrich | E4250-1G | See Table 2 |
Ethanol | Fisher Scientific | 2701 | |
Ethanolamine | Sigma-Aldrich | E0135-500ML | 16.6 mM solution; See Table 2 |
Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA) | TCI America | E0084 | |
Fetal Bovine Serum (high performance FBS) | Invitrogen | 10082147 | See Table 1 |
Forskolin | Sigma-Aldrich | F6886-50 | Prepare a 10 mM stock solution of 4.1 mg in 1 mL of DMSO |
Growth Factor-Reduced Matrigel | Corning, Inc. | 356231 | Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, Phenol Red-Free, LDEV-Free, 10 mL. |
Hemacytometer | Hausser Scientific | 1483 | |
Human Collagen Solution, Type I (VitroCol; 3 mg/mL) | Advanced BioMatrix | 5007-A | Collagen solution |
HyClone (aka FetalClone II) | GE Healthcare | SH30066.03HI | See Table 2 |
Hydrocortisone | StemCell Technologies | 07904 | See Tables 1 and 2 |
Insulin, human recombinant, zinc solution | Life Technologies | 12585014 | 4 mg/mL solution; see Table 2 |
IVF 4-Well Dish, Non-treated | NUNC (via Fisher Scientific) | 12566350 | 4-well plate for spheroids; similar well size to a 24-well plate |
MEF-CF1-IRR | Globalstem | GSC-6001G | Irradiated murine embryonic fibroblasts |
Metamorph 7.7 | Molecular Devices | Analysis Software; https://www.moleculardevices.com/systems/metamorph-research-imaging/metamorph-microscopy-automation-and-image-analysis-software for a quote | |
Olympus IX51 Inverted Microscope | Olympus Corporation | Discontinued | Imaging Microscope. Replacment: Olympus IX53, https://www.olympus-lifescience.com/pt/microscopes/inverted/ix53/ for a quote |
Pen Strep | Life Technologies | 15140122 | See Table 2 |
Phsophoryletheanolamine | Sigma-Aldrich | P0503-5G | See Table 2 |
Retinoic Acid | Sigma-Aldrich | R2625-50MG | See Table 2 |
Rhinoprobe | Arlington Scientific, Inc. | 96-0905 | Nasal curette |
Slidebook 5.5 | 3i, Intelligent Imaging Innovations | Discontinued | Imaging Software. Replacement: Slidebook 6, https://www.intelligent-imaging.com/slidebook for a quote |
Sterile Phosphate Buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 20012050 | |
Sterile Water | Sigma-Aldrich | W3500-6X500ML | |
Tissue Culture Dish 100 | Techno Plastic Products | 93100 | Tissue culture dish for expansion |
Tobramycin | Sigma-Aldrich | T4014-100MG | See Table 1 |
Transferrin (Human Transferrin 0.5 mL) | Lonza | CC-4205 | See Table 2 |
Triiodothryonine | Sigma-Aldrich | T6397-1G | 3,3′,5-Triiodo-L-thyronine sodium salt [T3]; See Table 2 |
Trypsin from Porcine Pancreas | Sigma-Aldrich | T4799-10G | |
Ultroser-G | Crescent Chemical (via Fisher Scientific) | NC0393024 | 20 mL lypophilized powder; See Table 2 |
Vancomycin hydrochloride from Streptomyces orientalis | Sigma-Aldrich | V2002-5G | See Table 1 |
VX770 | Selleck Chemicals | S1144 | Prepare a 1 mM stock solution of 0.4 mg in 1 mL of DMSO |
VX809 | Selleck Chemicals | S1565 | Purchase or prepare a 10 mM stock solution of 4.5 mg in 1 mL of DMSO |
Y-27632 Dihydrochloride ROCK inhibitor | Enzo LifeSciences | ALX-270-333-M025 | See Table 1 |